湖北白猪导入OMT/PGH基因的整合、表达和遗传

以湖北白猪为实验材料,显微注射OMT/PGH基因(绵羊启动子和猪生长激素的融合基因)于1125枚1～4细胞期的早期胚胎核内,共产仔167头,产仔率14.8%。Dot(斑点杂交)和Southern blot(印迹转膜杂交)检测,29头阳性,阳性率17.9%。通过传代进行转基因的遗传分析。G_0×G_0的配种组合,产仔63头,其中阳性20头,阳性率31.7%;G_0×非转基因猪的组合,产仔66头,其中阳性10头,阳性率15.2%。对11头G_0猪血清用放射免疫法测定的结果,其生长激素的浓度相当于对照组的2.03～6.70倍。16头G_0猪180日龄的生长速度比同窝对照提高11.8%;11头G_1猪比同窝对照提高14.8%,饲料转化率提高10%,瘦肉率有提高的趋势。

赤桉木质素合成途径OMT基因家族的原核表达与纯化研究

双子叶植物的木质素主要由愈创木基单体和紫丁香基木质素单体聚合形成,这两种单体的比例对造纸过程中木质素去除难易程度具有重要的影响。植物OMT基因家族的CCoAOMT和COMT基因是木质素合成途径的关键酶基因,可调控植物体内木质素单体的比例与含量。本文以所克隆的赤桉COMT、CCoAOMT1、CCoAOMT2三个基因的cDNA为模板,分别构建pET-32a的原核表达质粒,并优化在大肠杆菌BL21(λDE3)中的表达体系。结果显示,在加入0.4 mmol IPTG诱导表达后,COMT、CCoAOMT1、CCoAOMT2的原核表达质粒分别在4 h、2 h和3 h后达到可溶性重组蛋白表达峰值。通过渗透休克纯化方法,可在原核表达菌株的周质空间提纯CCoAOMT1和CCoAOMT2重组蛋白,在原核表达菌株的细胞质中可提纯COMT重组蛋白。

美洲黑杨CCoA OMT基因cDNA克隆及反义植物表达载体构建

据已报道的CCoA OMT(caffeoyl-CoA3-O-methyltransferase)基因的cDNA序列设计一对兼并引物,从美洲黑杨当年生嫩枝的次生木质部中提取总RNA,通过RT-PCR的方法获得约750bp的特异性扩增产物。测序结果显示,克隆的序列与GenBank中注册的CCoAOMT基因cDNA同源性最高达99%。该基因的cDNA序列已在GenBank上登录(登录号:EF153198)。将克隆的美洲黑杨CCoAOMT基因的cDNA序列反向连接到植物表达载体pBI121中CaMV35S启动子的下游,成功构建了美洲黑杨CCoAOMT基因的反义表达载体pBI-CCoAOMT,为进一步通过反义技术降低杨树木质素含量奠定了基础。

莲NnOMT和NnNMT基因家族的鉴定与分析

目的:莲苄基异喹啉生物碱(BIAs)的生物合成途径的解析具有重要的理论和经济价值,为了更好地促进莲BIAs生物合成途径的解析,本研究对莲氧甲基转移酶(NnOMT)、莲氮甲基转移酶(NnNMT)基因家族进行鉴定和生物信息学分析。方法:在莲全基因组的基础上,利用UniPort、美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库对莲NnOMT、NnNMT基因家族进行鉴定,分析其理化性质及亚细胞定位。利用TBtools、MEME、MEGA 11.0、FigTree 1.4.4等工具对前期鉴定出的NnOMT、NnNMT基因的系统发育、序列特征、基因结构、功能注释、顺式作用元件等进行分析。结果:共鉴定出61个莲NnOMT、NnNMT基因,编码的氨基酸数目介于168~580 aa,等电点范围为4.76~9.16,相对分子质量为18699.52~64934.53 Da,大部分表现为酸性且多为亲水蛋白,含有10个保守基序;京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析共富集到12个通路,包括新陈代谢、异喹啉生物碱生物合成、苯丙烷的生物合成等;基因本体(GO)富集结果可视化显示,61个莲NnOMT、NnNMT基因共注释到32个类别,其中包括16项分子功能,如谷氨酸合成酶还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)活性、外肽酶活性,以及16项生物过程,如四氯化碳代谢过程、厌氧四氯化碳代谢过程、对外源生物刺激的反应。在莲NnOMT、NnNMT基因的启动子区存在多种顺式作用元件,主要为启动子和增强子区响应元件、光响应和茉莉酸甲酯响应元件。结论:该研究基于莲的基因组数据对61个莲NnOMT、NnNMT基因进行了全面的生物信息学分析,为莲NnOMT、NnNMT基因家族的基因结构和功能研究奠定了基础,并为莲BIAs的生物合成途径解析提供了参考。

茶树CCoAOMT基因克隆及启动子的结构分析

茶树咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是甲基化EGCG生物合成的一种重要酶,为探明CCoAOMT基因的表达调控规律,进一步解析甲基化EGCG生物合成的调控机制。本研究采用同源克隆法获得了茶树CCoAOMT的cDNA全长序列,采用染色体步移技术(Genome walking)获得了该基因的启动子序列,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明,CCo AOMT全长cDNA为1 000 bp,其中开放阅读框长735 bp,编码245个氨基酸,含有caffeoyl-CoA O-methyltransferase和SAM功能结构域;进一步分离得到CCoAOMT基因上游调控序列1 624 bp,发现其含启动子核心元件TATA-box、CAAT-box及5'UTR Py-rich stretch (高水平转录顺式作用元件)、MYB (干旱诱导时的MYB结合位点)、G-box、GAG-motif、GATA-motif、GT1-motif、Sp1 (光响应元件)、CGTCA-motif、TGACG-motif (茉莉酸甲酯响应元件)等重要顺式作用元件。由结果推测,CCoAOMT基因在转录水平受各类转录因子的调控,该结论为进一步研究CCoAOMT基因的转录调控机制提供了理论指导。

茶树甲基化EGCG生物合成相关OMTs基因的鉴定及表达

茶树O-甲基转移酶(OMT)可催化甲基化EGCG的生物合成.为进一步获得甲基化EGCG生物合成的关键OMT基因,以不同甲基化EGCG含量的茶树品种金观音(JGY)、金牡丹(JMD)和福鼎大白(FD)为试验材料,基于茶树基因组和转录组数据,通过生物信息学方法,对筛选获得的OMTs基因进行染色体定位、基因结构特征、编码蛋白特性和系统进化关系分析,同时采用实时荧光定量PCR验证茶树OMTs在不同茶树品种的相对表达水平.结果显示,共鉴定出5个在金观音与福鼎大白以及金牡丹与福鼎大白比较组合中显著上调表达的OMT基因,其编码序列(CDS)全长和编码氨基酸的数目分别在528-1122 bp和175-373 aa之间,命名为CsOMT1-CsOMT5.系统发育树分析显示,茶树OMT蛋白分别与已知的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶、咖啡酸O-甲基转移酶、黄腐酚4-O-甲基转移酶和类黄酮3′,5′-甲基转移酶等具有较近的亲缘关系.基因结构分析结果显示,结构相似的OMTs成员多聚在同一个分支,这些结果与系统发育分析的结果一致.转录组结果表明,5个OMTs基因在富含甲基化EGCG的金观音和金牡丹中具有较高转录水平;实时荧光定量PCR表达分析显示,除OMT2之外,其余4个OMTs基因在3个茶树品种的相对表达水平差异显著,总体表现为在福鼎大白中表达量较低,而在金观音和金牡丹中相对表达水平显著上升.上述研究表明鉴定获得的CsOMT1、CsOMT3、CsOMT4和CsOMT5可能参与甲基化EGCG的生物合成,结果可为茶树甲基化EGCG生物合成的调控机制研究奠定理论基础.