PMCA1-4及其A端和C端剪接变异体在成年大鼠前庭组织中的表达

目的研究质膜钙ATP酶异构体1-4(plasma membrane Ca^(2+)-ATPase 1-4,PMCA1-4)在成年大鼠前庭组织的分布部位,及其A端和C端剪接变异体的表达类型。方法选择8周龄健康SD大鼠,解剖出内耳器官行前庭切片,同时取前庭椭圆囊斑和球囊斑提取总RNA。通过免疫荧光方法检测PMCA1-4在成年大鼠内耳前庭组织的表达部位,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PMCA1-4的A端和C端剪接变异体在成年大鼠前庭组织的表达类型。结果球囊和椭圆囊荧光染色切片中,于毛细胞和支持细胞的胞体外侧膜可见PMCA1表达,毛细胞纤毛中可见PMCA2强表达,毛细胞和支持细胞的胞体外侧膜可见PMCA3弱表达,PMCA4几乎不表达。4种PMCA亚型在球囊表达的剪接体分别为PMCA1x/b、PMCA2w/b、PMCA3z/(a,b)和PMCA4x/b,它们在椭圆囊的表达类型与球囊相同。结论PMCA1-4在成年大鼠前庭器官的表达部位存在差异,这4种PMCA亚型的剪接体类型也各不相同。这种差异性可能是为了满足前庭组织和亚细胞结构域对Ca2+调节的特殊需求。

FoxM1剪接异构体在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义

目的观察FoxMl剪接异构体在女性上皮性卵巢癌中的表达特征，并探讨其应用价值。方法恶性组50例，为经手术治疗及术中获取病灶组织病理检测确诊的上皮性卵巢癌患者；良性组50例，为影像学及病理诊断为卵巢良性肿瘤者；正常组50例，为其他妇科疾病入院但经临床症状、影像学检查等未见卵巢异常者。均取卵巢病理组织切片免疫组化染色，免疫荧光法检测FoxM1表达阳性情况。结果恶性、良性和正常组卵巢组织FoxM1的表达阳性率比较差异有统计学意义（x2=21．141，P〈0．001），两两比较，恶性组显著高于良性组及正常组（x2=16．284、5．363，P〈0．01），良性组显著高于正常组（X2=10．187，P〈0．01）；统计结果显示FoxM1阳性表达与上皮性卵巢癌FIGO分期、分化程度以及淋巴结转移密切相关，差异有统计学意义（P〈0．05或〈0．01）；经单因素、多因素分析显示，只有FIGO分期、淋巴结转移可作为上皮性卵巢癌患者的独立预后因素。结论FoxM1剪接异构体在上皮性卵巢癌中呈现为高表达，且与上皮性卵巢癌FIGO分期、分化程度、病理分型以及淋巴结转移密切相关；经分析，上皮性卵巢癌患者的独立预后因素为FIGO分期、淋巴结转移和FoxM1表达阳性。

质膜钙ATP酶异构体1～4的剪接体在新生大鼠前庭器官的表达

目的研究质膜钙ATP酶异构体(plasma membrane Ca^(2+)-ATPase isoforms,PMCAs)1~4(PMCA1~4)的A端和C端剪接变异体在新生大鼠前庭器官的表达。方法取出生2天的健康SD大鼠10只,断头后分离出前庭器官(椭圆囊斑和球囊斑),提取总RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测PMCA1~4的A端和C端剪接变异体的表达。结果在新生大鼠的椭圆囊斑和球囊斑PMCA1~4表达的剪接体分别为PMCA1x/b,PMCA2w/(a、b),PMCA3z/(a、b、c)和PMCA4(x、z)/b。结论在新生大鼠前庭器官,PMCA1、PMCA2、PMCA3和PMCA4之间表达的A端和C端剪接变异体类型均不同,这可能是由于椭圆囊斑和球囊斑对这些PMCA亚型有着不同的Ca2+调节需求。

ERCC1新的mRNA剪接异构体及其在顺铂处理细胞中的变化

为了考察用顺铂处理肺癌和宫颈癌细胞后,ERCC1的mRNA选择性剪接是否发生变化,通过提取处理的肿瘤细胞和对照细胞的总RNA,进行RT-PCR检测,对出现的剪接异构体目的条带进行TA克隆、测序鉴定。结果发现了2个新的ERCC1的mRNA剪接异构体,其中缺失外显子7-9的异构体在所检测的多种癌细胞中普遍存在,并且在顺铂处理下,其所占比例会随顺铂浓度的升高而增加。该异构体的变化揭示细胞可能会通过pre-mRNA选择性剪接调控ERCC1的功能。

NR4A2基因及其选择性剪接异构体与胃癌发生及转移的关系

目的:检测胃癌中NR4A2(又称Nurr1)基因的表达,从NR4A2调控机制出发寻找相关选择性剪接异构体,探讨其与胃癌发生和转移的关系。方法:通过选择性剪接数据库(ASD)预测NR4A2基因可能存在的选择性剪接异构体,半定量PCR检测NR4A2及异构体的表达,基因测序技术鉴定新的剪接异构体;实时定量PCR检测41例样本中NR4A2及剪接异构体的表达水平;免疫组织化学方法检测28例样本中NR4A2蛋白表达。结果:NR4A2基因在胃癌原位、癌旁、转移组织中均有表达,确定了2种剪接异构体NR4A2-Ⅰ和NR4A2-Ⅱ。实时定量PCR检测41例样本中NR4A2及2种异构体在癌旁组织表达水平高于原位癌(P=0.017,P=0.007,P=0.004);在肝转移灶中表达水平低于原位癌(P=0.001,P=0.018,P=0.016),差异有统计学意义。免疫组化检测发现癌旁组织中NR4A2表达阳性率高于原位癌及转移灶,但差异无统计学意义(P=0.672)。结论:胃癌原位、癌旁和转移组织中至少存在NR4A2基因的2种剪接模式;NR4A2及异构体的表达变化与胃癌发生和转移相关。

胶质瘤细胞中上皮剪接调控蛋白1(ESRP1)对人髓细胞白血病基因(MCL1)剪接的调控

目的研究胶质瘤细胞系U251中上皮剪接调控蛋白1(ESRP1)对人髓细胞白血病基因1(MCL1)转录本剪接的调控作用。方法对胶质瘤患者数据库中MCL1的测序结果进行数据挖掘,寻找关键位点。构建pc DNA-ESRP1外源表达载体并在U251细胞中进行过表达,通过反转录PCR和Western blot法检测MCL1不同异构体的表达情况。结果 ESRP1在U251细胞中的蛋白表达水平较正常胶质细胞低,MCL1异构体1在U251细胞中的表达高于正常胶质细胞,而异构体2和异构体3的表达则低于正常胶质细胞;在U251细胞中过表达ESRP1以后,发现异构体1表达较未转染组下降,而异构体3表达则显著升高,异构体2表达无明显变化。此外,第801G、802A缺失的MCL1无法被ESRP1正确剪切,异构体1和异构体3的表达与ESRP1转染前后无显著差异。结论抑制ESRP1表达或RNA识别位点突变可以引起肿瘤中癌基因转录本剪接异常。

ORMDL3剪接异构体的鉴定及在反复喘息患儿中的表达水平分析

目的对反复喘息儿童外周血中血清类粘蛋白1样蛋白3(ORMDL3)的剪接异构体ORMDL3-v1进行鉴定并对其表达水平进行分析。方法反复喘息儿童外周血提取RNA,根据ORMDL3-v1的mRNA序列,设计引物行5′-RACE实验,鉴定其是否存在。随后选择48名患有反复喘息的5岁以下儿童,分为喘息A组28例和喘息B组20例;正常对照组选取的是32例正常体检的儿童,检测外周血ORMDL3-v1及其野生型ORMDL3基因的表达水平。同时计算ORMDL3-v1/ORMDL3的比值,并分析各组病例的临床特点。结果5′-RACE实验证实反复喘息儿童外周血中存在ORMDL3-v1的表达。正常对照组ORMDL3-v1及ORMDL3基因表达水平都显著低于喘息A组和B组(P<0.01),喘息B组ORMDL3的表达水平显著低于A组(P<0.01),喘息A组和B组ORMDL3-v1的表达水平在统计学上差异不明显(P>0.05)。喘息A组ORMDL3-v1/ORMDL3的比值与喘息B组无差异(P>0.05),二者均低于正常对照组(P<0.01)。结论ORMDL3-v1及ORMDL3的表达水平与5岁以下儿童的反复喘息密切相关。

人mcl1不同亚型在结肠癌组织中表达变化的临床意义

目的探讨人mcl1基因不同亚型在结肠癌组织中差异表达的临床意义。方法采用RT-PCR和Western blot分别检测正常结肠组织、结肠腺瘤、结肠腺癌组织以及相应的癌旁组织各20例中mcl1基因三种m RNA剪接异构体和三种蛋白亚型的表达水平,进而分析这些亚型表达差异与肿瘤临床病理特征之间的相关性。结果 mcl1基因亚型1在结肠肿瘤组织及相应旁组织中的m RNA和蛋白质水平表达均高于正常组(P=0.009,P=0.022),且腺癌组中的m RNA和蛋白质水平表达亦高于腺瘤组(P=0.004,P=0.034)。亚型2在结肠肿瘤组织及对应旁组织中的m RNA和蛋白质水平表达均高于正常组(P=0.002,P=0.011),且腺癌组中的m RNA和蛋白质水平表达亦高于腺瘤组(P<0.001,P=0.007)。亚型3在结肠肿瘤组织及对应旁组织中的m RNA和蛋白质水平表达均高于正常组(P=0.027,P=0.045),但肿瘤组与相应旁组织之间以及腺癌组与腺瘤组之间的比较差异均无统计学意义。结论研究表明mcl1亚型1和亚型2对结肠癌肿瘤恶性程度呈正相关,可以作为临床评估结肠癌恶性程度有效的诊断指标之一。而亚型3可以作为肿瘤早期诊断的标志物,但其表达水平与恶性程度无明显相关性。

恒河猴XC趋化因子受体1(XCR1)基因的克隆和体外表达

目的了解恒河猴XC趋化因子受体1(XCR1)基因特征,并在HEK293T细胞上表达。方法采用反转录PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆恒河猴XCR1基因、并与GenBank中其他物种XCR1的cDNA序列进行比对。构建真核表达载体3.1-XCR1并转染HEK293T细胞,采用流式细胞术、Western blot法和激光扫描共聚焦显微镜技术检测XCR1蛋白的表达。结果恒河猴XCR1 cDNA序列全长1665 bp,包含415 bp的5'非翻译区(5'UTR)、1003 bp的编码区和248 bp的3'UTR;恒河猴XCR1编码区氨基酸序列与人XCR1的相似性为96.8%,而且具有相似的结构特征:含有七次跨膜结构,酸性N端以及保守的G蛋白锚定功能性基序HRYLSVV。与基因组序列比对和跨外显子反转录PCR结果表明,在恒河猴多种组织中只存在缺失第二外显子的剪接变异体。恒河猴XCR1可在HEK293T细胞中表达Mr40 000左右的分子、主要分布于细胞质和细胞膜上。结论除mRNA剪接异构体以外,恒河猴XCR1分子与人高度相似,并且能在HEK293T细胞中有效表达。

鼠源Bif-1蛋白7种选择性剪接异构体真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建鼠源Bif-1(Bax-interacting factor-1)蛋白7种选择性剪接异构体(alternatively spliced isoforms)真核表达质粒,并在BHK和N2a细胞中表达。方法以提取的N2a细胞总RNA为模板,采用RT-PCR、重叠延伸PCR等方法扩增目的基因Bif-1(transcript variant 1、transcript variant 2、transcript variant 3、transcript variant x1、transcript variant x2、transcript variant x3、e),并将目的基因连入真核表达载体p IRES2-EGFP,构建重组质粒。重组质粒经鉴定正确后经脂质体介导转染BHK和N2a细胞,采用荧光显微镜观察及Western blot法检测转染细胞中Bif-1蛋白的表达。结果琼脂糖凝胶电泳可见与预期大小相符的核酸条带;重组质粒经PCR、双酶切、测序鉴定证明构建正确;重组质粒转染BHK或N2a细胞后荧光显微镜下可见绿色荧光;Westen blot可检出相应大小的目的条带。结论成功构建了鼠源Bif-1蛋白7种选择性剪接异构体真核表达质粒,并在BHK和N2a细胞中获得表达。为进一步探索Bif-1蛋白不同选择性剪接异构体的生物学功能,研究其在细胞自噬、细胞凋亡以及抗肿瘤等方面的作用奠定了基础。

调节阿片受体MOR胞内信号转导的分子机制研究进展

阿片受体MOR主要负责阿片类药物的镇痛作用,其胞内信号转导机制已能够被系统地阐述。本综述通过系统地整理近几年来的文献,较详细地介绍了阿片受体MOR产生镇痛作用的完整信号转导过程及调节其信号转导的多种蛋白质。本综述总结了已知影响阿片受体MOR功能发挥的MOR基因OPRM1剪接异构体、离子通道、外周性阿片肽和晶体结构的最新知识,以探讨阿片类药物在疼痛治疗中的应用和临床价值。

IRAK家族中TIR信号通路的关键因子

IRAKs(Interleukin-1 receptor associated kinases,IRAKs)作为TIR信号通路的重要连接体,在调节机体的自身免疫中起着重要的枢纽作用。家族成员包括IRAK1、IRAK2、IRAKM和IRAK4,目前还鉴定出8个剪接异构体。其中IRAK1和IRAK4有激酶活性,通过与MyD88和TRAF-6连接成复合物启动TLRs/IL-1介导的信号途径;而IRAK2和IRAKM则无激酶活性,对通路起着负调节作用。本文从IRAK的分子特点、作用和机制、与其它因子间联系及相应剪接异构体作一综述。

FoxM1与癌发生的相关剪接机制的探讨

FoxM1是一种原癌基因。它也是癌发生、发展密切相关的重要的转录因子。Fox M1是Forkhead Box转录因子家族重要成员,定位于染色体12p13.3,特异性表达于增殖期细胞中,在细胞终末分化时消失,是一个典型的与细胞增殖相关的转录因子,在细胞G/S及G/M期转换过程中发挥重要作用。它具有Fox M1A、B和C三种剪接异构体。Fox M1B和C在癌组织中高表达,发挥转录激活、促癌发生和发展的作用,而Fox M1A在癌组织中低表达,发挥转录抑制功能。癌组织中Fox M1B/C的优先选择对于Fox M1发挥促癌作用非常关键。因此对这一现象的成因即Fox M1癌相关选择性剪接机制的研究非常重要。

WT1＋17AA异构体在急性髓系白血病中的表达特点

WT1基因定位于11p13,可通过选择性剪接编码4种异构体：WT1A（-17AA/-KTS）、WT1B（＋17AA/-KTS）、WT1C（-17AA/＋KTS）、WT1D（＋17AA/＋KTS）.许多文献证实80%～90%的急性白血病无论型别均过表达野生型WT1基因,新近研究表明WT1基因调节细胞周期和凋亡途径,WT1＋17AA异构体在内源性凋亡途径中在线粒体上游某些位点起着抗凋亡作用.了解不同亚型、不同病程阶段的急性髓系白血病（AML）中WT1基因及其异构体比例对于AML的发病机制的阐释非常重要.

人MCL1不同亚型在结肠癌中表达变化的临床意义

目的以MCL1基因为例,研究不同亚型在结肠癌组织中差异表达的临床意义。方法采用RT-PCR和WB分别检测正常结肠组织、结肠腺瘤、结肠腺癌组织以及对应的癌旁组织各20例中MCL1基因3种mRNA剪接异构体和3种蛋白亚型的表达水平,进而通过χ2检验分析了这些亚型表达差异在213例肿瘤临床病例中与肿瘤病理特征之间的相关性。结果 MCL1基因亚型1在结肠肿瘤组织及对应旁组织中的表达均高于正常组(mRNA,P=0.009;蛋白,P=0.022),且腺癌组中的表达亦高于腺瘤组(mRNA,P=0.004;蛋白,P=0.034)。亚型2在结肠肿瘤组织及对应旁组织中的表达均高于正常组(mRNA,P=0.002;蛋白,P=0.011),且腺癌组中的表达亦高于腺瘤组(mRNA,P<0.001;蛋白,P=0.007)。亚型3在结肠肿瘤组织及对应旁组织中的表达均高于正常组(mRNA,P=0.027;蛋白,P=0.045),但肿瘤组与对应旁组织之间以及腺癌组与腺瘤组之间的比较均无统计学意义。此外MCL1亚型1和亚型2对结肠癌肿瘤恶性程度呈正相关,而亚型3可以作为肿瘤早期诊断的标志物,但其表达水平与恶性程度无相关性。结论在临床评估结肠癌恶性程度过程中,位于核表达的MCL1亚型2可以作为有效的诊断指标,本研究为MCL1引物设计以及抗体选择提供一定参考价值。

OCT4B1在牙髓细胞的表达及其对凋亡相关因子的调控作用

目的研究人牙髓细胞(HDPCs)中八聚体转录结合因子4剪接异构体B1(OCT4B1)的表达及基因转染OCT4B1后对凋亡相关因子的影响。方法实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和荧光原位杂交(FISH)技术检测正常HDPCs中OCT4B1的表达;利用慢病毒载体构建OCT4B1高表达模型并转染HDPCs,检测半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶(Caspase)3和7的表达变化。结果 OCT4B1表达于正常HDPCs且在第三代中表达最高;上调OCT4B1后与空载体组相比,OCT4B1高表达组Caspase-3、Caspase-7 mRNA表达降低(P<0.05)。结论 HDPCs中上调OCT4B1可抑制Caspase-3和Caspase-7的表达,说明OCT4B1参与细胞应激反应,可能与细胞凋亡相关。