羊传染性脓疱病毒ORF047基因表达及其蛋白在细胞中的定位分析

目的克隆羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)ORF047基因,并进行真核表达及亚细胞定位,为筛选与其相互作用的蛋白提供依据。方法提取羊传染性脓疱病毒分离株的DNA,以其为模板,参照OV-SA00毒株(NC-005336.1)基因ORF047序列,采用PCR技术扩增ORFV ORF047基因片段,凝胶回收后将其插入pEGFP-N1载体,构建重组质粒pEGFPORF047,测序后重组质粒共转染293T细胞,Western blotting鉴定融合蛋白的表达。后将重组质粒pEGFP-ORF047与pHcRed1-Nuc、pHCRed1-mito、pHcRed1-ER分别共转染Vero-E6细胞,通过激光共聚焦显微镜对融合蛋白进行亚细胞定位分析。结果 ORFV ORF047基因片段大小为735bp;重组质粒pEGFP-ORF047能够在293T细胞中明显表达融合有目的分子的绿色荧光蛋白,Western blotting检测表达的融合蛋白大小约54kD;亚细胞定位分析表明,ORF047蛋白主要定位于胞浆中,少量在线粒体中。结论成功分析了ORF047基因的表达与其蛋白在亚细胞定位。