猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株编码复制酶聚蛋白ORF1的克隆及结构特征分析

应用RT-PCR方法扩增了猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株编码复制酶聚蛋白的ORF1序列,将其进行克隆、序列测定和分析。确认SC-Y株ORF1全长20 053 nt(GenBank收录号DQ390461)。该序列包含2个ORF,其中ORF1a由12 053个核苷酸构成,可编码由4 018个氨基酸组成的多肽,ORF1b由8 036个核苷酸构成,可编码由2 678个氨基酸组成的多肽。对SC-Y与TGEV参考毒株及不同冠状病毒对应区进行序列比较,结果显示,SC-Y株与PUR46-MAD株的同源性最高,ORF1a的核苷酸同源性为99.5%,推导氨基酸同源性为99.2%,ORF1b的核苷酸及推导氨基酸同源性均为99.8%;不同冠状病毒之间ORF1b比ORF1a具有更高的保守性。

猪戊型肝炎病毒重组蛋白ORF2-V1单克隆抗体的制备及抗原表位差异分析

用纯化的猪戊型肝炎病毒DQ株重组蛋白ORF2-V1免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经3次克隆和间接ELISA筛选,获得了αC11,αC12,γH1,γF8,BC4和CH86株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过间接ELISA测定,单抗效价为:细胞培养上清1∶1.60×103～1∶3.20×103,腹水为1∶1.28×106～1∶2.56×106;经ELISA法测定,6株单克隆抗体均与重组蛋白ORF2-V1反应,而不与ORF2其它部分片段的蛋白反应;将试验中制备的MAbs分别用HEVswDQ株感染的A549细胞涂片进行IFA检测,同时分别用猪的阳性、阴性血清和SP2/0细胞上清做对照,制备的6株MAbs对感染细胞均呈现阳性反应,说明其可以与天然的病毒发生反应,并且与阳性多克隆血清比较,以单克隆抗体为一抗,IFA反应表现出良好的特异性。单抗的亚类鉴定结果表明,所有MAbs均为IgG1型,而且所有单克隆抗体的轻链均为κ链。单克隆抗体抗原识别位点分析结果表明,6株单抗分别针对4个不同抗原位点,McAb-γH1,BC4,CH8识别的位点各不相同,其中McAb-γH1,BC4识别的位点有部分重叠,McAb-αC11,αC12,γF8识别同一位点,位于γH1,BC4识别位点的重叠区内。

抗猪戊型肝炎病毒重组蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

利用纯化的猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2-M1重组蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,获得了2株稳定分泌抗HEV ORF2-M1重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为BC4和2A10。经ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1∶1.60×103和1∶0.80×103,接种小鼠的腹水效价分别为1∶2.56×106和1∶1.28×106。2株单抗均能特异性识别重组ORF2-M1蛋白,但它们识别ORF2-M1蛋白的不同表位。间接免疫荧光试验证实,2株单抗具有良好的特异性,均能够识别HEV。

戊型肝炎病毒ORF1多聚蛋白的不同功能域在细胞内的定位

为了探讨戊型肝炎病毒多聚蛋白ORF1的多个功能域在宿主细胞中的表达和定位情况,我们首先将psk-HEV重组载体上的ORF1各功能域的编码序列克隆到绿色荧光蛋白载体pcDNA3.1-GFP上,构建成融合表达的重组质粒,并测序和酶切鉴定其构建成功。再通过Western-Blot验证各融合蛋白在细胞中正确表达,并用激光扫描共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内的分布和定位。在Huh7细胞中,RdRp蛋白主要分布于细胞核内,HEL蛋白以囊泡状分布于细胞核周,MET蛋白以颗粒状存在于细胞核和细胞质中,PLP蛋白呈极性分布于细胞核周,X蛋白在细胞核和细胞质中均存在。各融合蛋白在细胞中的不同定位印证了对这些蛋白质的功能预测和体外研究结果,这为进一步研究HEV不同蛋白功能提供了支持。

截短表达的TTSuV2 ORF1重组蛋白对猪血清的免疫学反应

【目的】本文旨在了解猪细环病毒2(Torque teno sus virus 2,TTSu V2)病毒蛋白对猪血清的免疫学反应,明确TTSu V2 ORF1编码的氨基酸序列上特定片段的免疫原性,为TTSu V2的免疫学检测方法建立提供实验依据。【方法】以本实验室测序的TTSu V2毒株为研究对象,在大肠杆菌表达系统中克隆表达了TTSu V2ORF1基因上两相互重叠的基因片段,对表达产物进行纯化,分析了两重组蛋白(TTSu V2 ORF1a与TTSu V2ORF1ab)对猪血清抗体的免疫学反应。【结果】应用标签抗体进行Western Blotting分析的结果显示,重组TTSu V2 ORF1a与TTSu V2 ORF1ab蛋白成功表达。应用建立的ELISA方法对212份猪血清进行检测的结果表明,含有179个氨基酸的重组TTSu V2 ORF1a与含有416个氨基酸的重组TTSu V2 ORF1ab蛋白之间有显著的相关性,二者对猪血清的反应基本一致。采用猪血清进行Western Blotting分析的结果显示,血清抗体可特异性识别两重组蛋白。【讨论】TTSu V2 ORF1a与TTSu V2 ORF1ab相互重叠的179个氨基酸序列上(168-346)含有TTSu V2 ORF1关键的B细胞表位,重组蛋白TTSu V2 ORF1a适用于TTSu V2血清抗体免疫学检测。