鲤疱疹病毒3型ORF136基因编码蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

为了对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)ORF136基因编码蛋白进行功能研究和血清学诊断,本实验通过对ORF136基因推导的第31~157位氨基酸序列进行PCR扩增,并与原核载体pET-32a(+)连接,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)以制备ORF136多克隆抗体,运用Western blot和间接免疫荧光技术对抗体进行鉴定。结果表明,重组融合表达蛋白大小与预期一致,约为35 kD,且主要分布在包涵体中。Western blot分析显示,免疫兔后获得的纯化ORF136多克隆抗体能特异性识别纯化的CyHV-3和感染CyHV-3的KS细胞;间接免疫荧光分析进一步表明ORF136多抗能识别感染CyHV-3的KS细胞。ORF136多克隆抗体的制备为ORF136蛋白功能研究和CyHV-3血清学诊断方法的建立提供了重要基础。

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF136基因的原核表达及免疫原性研究

为了研究能有效预防锦鲤疱疹病毒(KHV)的疫苗,以KHV-CJ株为模板克隆了锦鲤疱疹病毒ORF136基因,并构建重组质粒PET32a-ORF136,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测获得含his标签大小为36.4 kDa的蛋白条带。蛋白纯化后免疫鲤鱼,不同天数采血收集血清用间接ELISA检测抗体水平。结果显示:用10、20和40μg/尾的蛋白免疫后均可检测到KHV抗体,用PET32a-ORF136表达的蛋白20和40μg/尾的蛋白免疫后的抗体水平比10μg/尾剂量蛋白免疫后的抗体水平高但差异不显著(P>0.05)。

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF136基因的克隆及生物信息学分析

为了了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF136蛋白的结构特征和进化关系,试验用锦鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取DNA,经PCR扩增获得ORF136基因,将其克隆到p MD18-T载体中构建重组质粒,应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF136基因的结构和功能,并与Gen Bank上已公布的KHV进行比较。结果表明:ORF136有2个跨膜区;抗原表位预测显示,抗原性良好;结构预测显示,可能存在1个潜在的N-糖基化位点和19个潜在的O-糖基化位点;BLAST比对分析显示,KHV-CJ ORF136与KHV-U ORF136和KHV-I ORF136的亲缘关系最近,与KHV-GZ11ORF136的亲缘关系较近,与KHV-GZ10 ORF136、KHV-QY08 ORF136和KHV-J ORF136亲缘关系最远,KHV-CJ可能来源于欧美国家和以色列。说明ORF136基因可能具有较好的免疫原性。