禽戊型肝炎病毒CaHEV-GDSZ01株ORF3蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

旨在对禽戊型肝炎病毒的ORF3蛋白进行原核表达,并制备其多克隆抗体,为进一步研究aHEV ORF3蛋白生物学功能新型疫苗提供生物材料。通过RT-PCR方法扩增CaHEV-GDSZ01株ORF3基因,连接pET-32a(+)表达载体以构建重组原核表达质粒,并转化BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达;利用SDS-PAGE凝胶电泳分析ORF3蛋白的表达形式后进行纯化,并免疫新西兰白兔以获得兔抗ORF3蛋白多克隆抗体,利用间接ELISA试验检测多克隆抗体的效价,利用Western Blot试验和间接免疫荧光试验(IFA)检测多克隆抗体特异性。结果显示,成功构建了pET-32a-ORF3重组原核表达质粒,并通过原核表达系统成功诱导表达了27 ku不可溶性的aHEV ORF3重组蛋白;Western Blot试验和IFA试验结果显示,制备的多克隆抗体可以特异性识别ORF3蛋白,ELISA结果显示,多克隆抗体效价为1∶51 200。成功表达CaHEV-GDSZ01株的ORF3蛋白,并制备了其多克隆抗体。

猪圆环病毒3型ORF3蛋白的原核表达及纯化

为了制备猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3, PCV-3)ORF3蛋白的抗原,试验采用PCR技术扩增ORF3基因;通过PCR和双酶切技术鉴定重组质粒pET28a(+)-ORF3;利用SDS-PAGE鉴定重组质粒pET28a(+)-ORF3的表达情况,并分析其是否为可溶性表达;采用包涵体纯化试剂盒纯化ORF3蛋白,并利用SDS-PAGE分析纯化情况。结果表明:PCR扩增得到ORF3基因,其大小为696 bp,并成功构建出重组质粒pET28a(+)-ORF3;该重组质粒可在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达,表达的ORF3融合蛋白以包涵体形式存在,纯化的蛋白条带单一。说明PCV-3 ORF3蛋白可被成功表达并纯化。

戊型肝炎病毒ORF3蛋白功能的研究进展

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒感染引起的经肠道传播的人兽共患疾病,文章就戊型肝炎病毒开放阅读框ORF3编码蛋白在细胞信号转导、病毒颗粒的释放及机体免疫抑制方面的功能研究进行了综述,旨在为深入研究戊型肝炎病毒的致病机理及抗戊型肝炎病毒疫苗的开发提供参考。

基因4型戊型肝炎病毒ORF3蛋白氨基酸变异的初步探讨

目的初步探讨戊型肝炎病毒（HEV）ORF3蛋白氨基酸变异情况，为其功能研究提供相关线索。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增41株基因4型HEVRNAORF3基因片段，将PCR产物与pMD18-TVector连接，转化到大肠埃希茵JM109筛选阳性克隆测序，然后采用DNAstar软件将测序结果翻译成氨基酸序列，初步探讨其变异情况及与基因1型HEVORF3蛋白差异。结果19株HEVRNAORF3扩增阳性，其长度均为345bp，编码蛋白含有114个氨基酸，共19个位点突变，突变分布于D2区、P1区和P2区，D1区无突变；与基因1型HEVORF3蛋白比较，基因4型HEVORF3蛋白的D1区、D2区、P1区和P2区均存在一个或多个氨基酸突变，P2区两个PXXP基序无突变。结论与基因1型HEVORF3蛋白比较，基因4型HEVORF3蛋白的D1区、D2区、P1区和P2区氨基酸均存在突变，这些变异是否影响我国基因4型HEVORF3蛋白结构和功能仍需进一步研究；但P2区两个PXXP基序高度保守，推测其可能在不同型HEV致病过程中起着重要的作用。

猪Ⅱ型圆环病毒江苏株全基因进化及ORF3蛋白的生物信息学分析

对NCBI已经登记的国内分离的PCV2江苏株(GQ358994.1)进行序列比对及进化分析,并对其ORF3编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学方法分析,对其组分、理化性质、跨膜结构域、二级结构、糖基化位点、磷酸化位点和B细胞抗原表位进行预测和推断。结果表明,PCV2江苏株与国内分离株序列同源性极高(>99%),ORF3蛋白无跨膜区域,二级结构中自由卷曲含量最高,为54.81%,不含有糖基化位点,但有8个磷酸化位点。综合分析得出,ORF3蛋白具有大量的抗原决定簇。通过对ORF3蛋白进行生物信息学方法分析,为PRRSV疫苗设计提供理论基础。

猪圆环病毒2型ORF3蛋白的原核表达及抗体检测ELISA方法的建立

通过外源表达PCV2 ORF3蛋白,为ORF3蛋白的抗体制备和检测提供基础材料。根据PCV2的ORF3基因序列设计特异性引物,克隆ORF3全基因,构建重组原核表达质粒,转入大肠埃希菌进行表达,将纯化的蛋白包被ELISA板,建立ORF3抗体检测ELISA方法。结果表明,获得了重组pGEX-6p-1-ORF3原核表达质粒,最佳表达条件为37℃,225 r/min,IPTG 1.0 mmol/L诱导5 h;建立的ELISA检测方法可以检测PCV2阳性血清,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清无交叉反应。本试验为ORF3抗体制备提供了基础材料,也为PCV2抗体检测提供了可选择方法。

猪戊型肝炎病毒ORF3蛋白影响HepG2细胞核黄素代谢的lncRNA-mRNA调控网络的鉴定

为初步鉴定并挖掘出猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)ORF3蛋白影响HepG2细胞核黄素代谢信号通路的lncRNA-mRNA调控网络,本试验通过构建腺病毒过表达载体,制备高滴度过表达腺病毒,介导猪HEV-ORF3在HepG2细胞中实现过表达。Western blotting检测ORF3蛋白过表达成功后,运用lncRNA高通量组学测序,筛选出差异表达的lncRNA并进行靶向差异基因预测,对lncRNA靶向差异基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,初步鉴定出与核黄素代谢信号通路相关的lncRNA-mRNA调控网络。Western blotting结果显示,在约为12 ku处出现目的条带,说明成功实现腺病毒介导猪HEV-ORF3在HepG2细胞中过表达。lncRNA高通量组学测序结果显示,共发现102个显著差异表达lncRNAs表达量上调,80个显著差异表达lncRNAs表达量下调。GO功能和KEGG通路富集分析显示,初步挖掘出lncRNA(MSTRG.13995.2)和lncRNA(MSTRG.1960.1)可能是与核黄素代谢信号通路相关的显著差异表达lncRNA,分别通过顺式调控其靶向基因APC-5和FLAD1来影响核黄素代谢信号通路。本试验初步鉴定出lncRNA(MSTRG.13995.2)-APC5和lncRNA(MSTRG.1960.1)-FLAD1可能是影响HepG2细胞核黄素代谢信号通路的lncRNA-mRNA调控网络。

禽戊型肝炎病毒中国分离株ORF3蛋白的真核表达与抗原性分析

【目的】为获得禽戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)中国分离株(CaHEV)ORF3基因重组蛋白,并对其抗原性进行分析【。方法】提取CaHEV总RNA,通过RT-PCR获得ORF3基因,构建重组质粒pFastBac-HTB-ORF3,转座DH10Bac感受态细胞,提取重组杆粒Bacmid-ORF3,转染sf9细胞,用SDS-PAGE、IFA和Western blot对重组蛋白表达进行鉴定。优化表达条件,将纯化的ORF3蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用制备的多抗分别与截短表达的3段CaHEV ORF3蛋白进行Western blot和ELISA检测,分析ORF3蛋白的抗原表位区。【结果】SDS-PAGE、Western blot和IFA结果表明CaHEV ORF3蛋白被成功表达且存在细胞内,昆虫细胞在接毒后4天表达量最高。将ORF3重组蛋白免疫小鼠,利用间接ELISA方法,对制备的多抗倍比稀释检测,效价达到104,Western blot和ELISA分析表明ORF3蛋白C端74—88氨基酸处具有较强的抗原性。【结论】本试验用Bac-to-bac系统成功构建含有CaHEV ORF3基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到表达,其主要抗原表位位于C端74—88氨基酸,为进一步研究禽HEV ORF3的蛋白结构和功能奠定了基础。

鸭圆环病毒ORF3蛋白多克隆抗体的制备与应用

鸭圆环病毒(DuCV)感染引起淋巴细胞凋亡,其ORF3蛋白是唯一具有凋亡活性的病毒蛋白,但目前ORF3特异性抗体的缺乏限制了其生物学功能的深入研究。DuCV包含基因I型和基因II型两种基因型,利用软件分析两基因型ORF3同源性,选取保守性肽段进行多肽合成,并与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,多次加强免疫兔子,采集血清并纯化IgG后制备ORF3多克隆抗体。ELISA检测发现此抗体能特异性与ORF3保守肽段反应,并具有较高的效价,间接免疫荧光(IFA)显示此抗体能特异性识别两基因型ORF3蛋白,但并不能用于westernblot检测,说明此多抗主要识别ORF3空间构象的表位。总之,我们成功制备了特异性识别两种基因型DuCVORF3蛋白的抗体,为今后深入探究DuCVORF3蛋白的生物学功能提供了良好的研究工具。

戊型肝炎病毒ORF3蛋白对人肝癌细胞中Ⅰ型干扰素及ISG15蛋白表达的影响

目的:探讨基因Ⅲ型戊型肝炎病毒(HEV)非结构蛋白开放阅读框3(ORF3)对体外培养的人肝癌PLC/PRF/5细胞中Ⅰ型干扰素(IFN-α和IFN-β)及干扰素刺激基因(ISG)15蛋白表达的影响。方法:分别用基因Ⅲ型戊型肝炎病毒ORF3质粒及空载质粒转染PLC/PRF/5细胞,在转染之后不同时间点(0h,8h,12h,24h,48h,72h,120h),用ELISA方法检测细胞上清液中Ⅰ型干扰素的含量,并用Western blot方法检测ISG15蛋白的表达。结果:ORF3组细胞上清液中IFN-α、β的水平均比空载组及空白组升高,而空载组与空白组之间无明显改变。并且ORF3组细胞中ISG15蛋白的表达增加,而空载组与空白组无明显改变。结论:基因Ⅲ型HEV的非结构蛋白ORF3促进Ⅰ型干扰素(IFN-α和IFN-β)及ISG15蛋白的表达。

戊型肝炎病毒Ⅰ型ORF3蛋白的表达、纯化及抗原性分析

目的 表达戊型肝炎病毒 (HEV)Ⅰ型ORF3全长基因片段 ,纯化表达产物并进行抗原性分析。方法 将Ⅰ型HEVORF3基因连接到融合表达载体pThioHisB ,IPTG诱导表达 ;Westernblot分析表达产物的抗原活性 ;用经高效液相色谱纯化的表达产物作为抗原 ,制备血清抗 HEVIgG及抗 HEVIgM诊断试剂 ,用国家参考品进行考核 ;用所得抗原检测临床血清中抗 HEV抗体 ,比较其与Genelabs试剂盒检测结果的差异。结果 含有Ⅰ型pThioHisB/ORF3质粒的菌株表达了相对分子质量(Mr)为 2 6× 10 3 的融合蛋白 ,免疫印迹表明其能与戊型肝炎患者恢复期血清发生特异性反应。国家参考品考核结果显示 ,用表达产物制备的抗HEVIgG诊断试剂阳性符合率为 10 0 % (10 / 10 ) ,阴性符合率为 96 .7% (2 9/ 30 ) ,总符合率为 97.5 % (39/ 4 0 ) ;制备的抗 HEVIgM诊断试剂阳性符合率为 83.3%(10 / 12 ) ,阴性符合率为 10 0 % (2 0 / 2 0 ) ,总符合率为 93.8% (30 / 32 )。与Genelabs公司试剂盒检测结果比较 ,抗 HEVIgG和抗 HEVIgMELISA总符合率分别为 94 .5 %和 87.0 %。结论 本实验所得全长ORF3基因工程表达产物具有良好的抗原性 ,可用于制备抗 HEV诊断试剂。

猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白40-91 aa是其细胞质定位的关键结构域

ORF3蛋白是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)基因组编码的唯一的辅助蛋白,与病毒毒力相关。为确定PEDV ORF3细胞质定位信号,文中构建了系列PEDV DR13wt ORF3蛋白全长或截短肽重组表达载体,转染Vero细胞并利用激光共聚焦显微镜分析与EGFP融合表达的全长ORF3蛋白和其系列截短肽在细胞内的分布。结果表明,全长ORF3蛋白或所有包含2个跨膜域的40–91 aa基序的ORF3截短肽均只定位于细胞质中,而不包含40–91aa基序的ORF3截短肽分布于整个细胞中(细胞质和细胞核均有分布)。这表明40–91 aa是猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白细胞质定位的关键结构域。PEDVORF3蛋白细胞质定位结构域的明确为进一步研究其细胞内转运和生物学功能提供了参考。

戊型肝炎病毒ORF3蛋白研究进展

戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）是戊型肝炎的病原体，是肝炎病毒科戊型肝炎病毒属的惟一成员，无包膜、正义、单链RNA病毒，病毒基因组全长约7．2kb，由3个开放阅读框ORFl、ORF2和ORF3组成，其中ORFl编码与病毒复制、转录相关的酶等非结构蛋白，ORF2编码660aa的病毒衣壳蛋白，ORF3编码小分子的磷蛋白。

戊型肝炎病毒ORF3蛋白对人肝细胞CCL13增殖及细胞周期的影响

目的 检测戊型肝炎病毒ORF3蛋白对人张氏肝细胞（Changliver,CCL13）增殖及细胞周期的影响.方法 将真核表达载体pDsRed-Monomer-N1-ORF3采用LpofectamineTM2000脂质体法转染CCL13细胞;用MTT比色法测定细胞增殖情况;用流式细胞仪碘化丙啶染色法检测细胞周期;并采用Western-Blot检测细胞周期蛋白的表达.结果 转染pDsRed-Monomer-N1-ORF3的CCL13细胞自第3天开始,增殖受抑（P＜0.01）;细胞周期阻滞于G0/G1期;细胞周期蛋白Cyclin Dl及Cyclin E1的表达受抑,Cyclin A2及Cyclin B1蛋白表达量与对照组无差异.结论 戊型肝炎病毒ORF3蛋白可通过抑制细胞周期蛋白Cyclin Dl及Cyclin E1的表达而抑制CCL13细胞的增殖.

戊型肝炎病毒ORF3及其蛋白的研究进展

戊型肝炎病毒(HEV)是发展中国家急性肝炎流行的重要病原体之一,由于缺少有效的细胞培养系统和廉价的小型动物模型,对病毒的生物学特性及发病机理了解较少。近几年在HEV ORF3及其蛋白的分子生物学特性和功能研究方面取得了一些进展,为深入了解HEV的感染和致病机理提供了新的理论依据,对这些研究成果进行了综述。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3基因的原核表达

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白的结构、功能及免疫学特性,根据GenBank中已发表的高致病性PRRSV HuN4株ORF3基因序列,设计合成扩增PRRSV ORF3基因的引物。将扩增的基因克隆到表达载体pProEx HTb中,转化到大肠埃希菌BL21进行表达。Western blot分析表明,GP3蛋白在大肠埃希菌中获得正确表达,且具有良好的反应活性。将纯化的GP3蛋白免疫小鼠制备抗GP3多克隆血清,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其效价,结果在小鼠体内产生较高滴度的特异性抗体,证明PRRSV GP3蛋白具有良好的抗原性。

猪流行性腹泻病毒黑龙江分离株ORF3基因的克隆、表达及分子进化分析

克隆2017年黑龙江省大庆地区流行PEDV毒株(HLJ/DQ/2017)ORF3基因,通过真核表达及分子进化分析方法,为研究ORF3蛋白生物学功能提供重要的实验基础。TRIzol裂解法提取病毒RNA,RT-PCR技术扩增ORF3基因片段并测序,克隆至p EGFP-N1载体上,转染至HeLa细胞。应用DNAStar、DNAMAN、MEGA5.0软件进行序列比对和发育树绘制,应用Western Blot技术、Immunofluorescence技术检测ORF3蛋白的表达和细胞定位。经过酶切和测序验证p EGFP-N1载体中正确插入了ORF3基因,Western Blot法、Immunofluorescence法证实ORF3-EGFP融合蛋白聚集成核表达在HeLa细胞质的局部,由进化树分析显示,该毒株和2015年黑龙江地区流行的两个株毒株(HLJ/2015/116、HLJ/2015/DP1-1)位于同一群,但相比2011年黑龙江地区爆发的毒株(CH/HLJ/HH-2/2011),前者亲缘关系更近一些。融合蛋白ORF3-EGFP在HeLa细胞中聚集成核表达,遗传进化分析表明,该毒株与2015年黑龙江省流行的PEDV毒株相比无较大变异,且为目前世界最为流行的PEDV毒株类型。

猪圆环病毒2型编码蛋白调控细胞凋亡机制研究进展

细胞凋亡是机体的一种先天免疫机制,通过清除不必要的或受损的细胞调节细胞内稳态。多数病毒会在感染期间,诱导大量淋巴细胞凋亡,抑制宿主的免疫反应,促进病毒的传播。其中猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)也在感染中利用各种途径来诱导或抑制细胞凋亡。该文主要论述PCV2相关蛋白如何与宿主蛋白相互作用并参与细胞凋亡的调控,以期为PCV2的发病机制和预防提供科学依据。

戊型肝炎病毒Ⅳ型的ORF3及ORF2蛋白的分片段表达、纯化及抗原性分析

目的 对戊型肝炎病毒 (HEV)Ⅳ型ORF3的全长基因片段和 4个覆盖全长ORF2的互相重叠的基因片段进行了表达 ,对表达产物进行了纯化及抗原性分析。方法 将O3、FB5、E4、F2 2和E5基因片段分别连接到融合性表达质粒pThioHis,用IPTG进行诱导表达 ,并用反向、分子筛、离子交换和亲和层析方法进行纯化 ,用纯化的蛋白分别制备检测抗HEVIgG的诊断试剂 ,用该试剂检测急性散发性的戊肝病人和非戊肝病人血清。结果 位于ORF2N 端的FB5蛋白在急性期的戊肝病人血清中具有最强的反应性 ;而且仍有部分被HEVⅠ型或 /和Ⅱ型的诊断试剂排除的急性非戊肝病人血清对HEVⅣ型的多肽呈阳性反应。结论 为早期诊断戊肝病毒的感染 ,其诊断试剂应含有HEVⅣ型的ORF2N

戊型肝炎病毒ORF_3蛋白功能的研究进展

戊型肝炎是一种由戊型肝炎病毒(HEV)引起的经肠道传播的病毒性肝炎。对HEV结构蛋白的深入研究有利于病毒感染机制的明确和疾病的预防。ORF3蛋白作为HEV结构蛋白之一,其具体功能目前仍不太清楚。一直以来,针对该蛋白的研究非常少,近年来研究发现HEV ORF3蛋白在细胞信号转导、病毒感染和免疫抑制等方面都有非常重要的作用。