猪TGEV HN-2012株ORF3a和ORF3b基因遗传变异分析及其真核表达研究

[目的] 研究猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）HN-2012株ORF3a和ORF3b基因的遗传变异情况。[方法] 根据GenBank公布的猪传染性胃肠炎病毒ORF3a和ORF3b基因序列,分别设计合成1对特异性引物,通过RTPCR从猪传染性胃肠炎病毒HN-2012株的cDNA中扩增ORF3a和ORF3b基因,经克隆测序后,将其基因序列与NCBI中不同来源的TGEV毒株的相应序列进行同源性分析,构建系统进化树并进行遗传变异分析,然后将ORF3a和ORF3b基因亚克隆至真核表达载体,构建pCAGGS-ORF3a-flag和pCAGGS-ORF3b-flag载体,转染293T细胞进行表达,利用flag标签抗体对2个基因的蛋白表达情况进行Western blot分析。[结果] TGEV HN-2012株的ORF3a基因与其他毒株间核苷酸的同源性为92.6%～100%,ORF3b基因与其他毒株间核苷酸的同源性为98.6%～99.7%。Western blot[结果]表明,ORF3a蛋白和ORF3b蛋白的分子质量约为8ku和28ku。[结论] TGEV HN-2012株的ORF3a基因与CH/JLY2/08、CH/HLJH/08株等亲缘关系较近,ORF3b基因与TS株、Miller M6株等亲缘关系较近,与我国其他毒株关系较远;成功实现了ORF3a和ORF3b蛋白在293T细胞中的表达。

新型冠状病毒辅助蛋白ORF3a、ORF3b的致病机制研究

目的探讨新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的非结构蛋白ORF3a、ORF3b在宿主细胞中的功能。方法采用细胞免疫荧光法检测SARS-CoV-2假病毒颗粒的组装和释放量,采用实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹法(Western blot)检测ORF3a、ORF3b对β干扰素(IFN-β)和炎症因子表达的影响,采用Western blot检测ORF3a、ORF3b对干扰素信号通路中蛋白表达的影响。结果荧光显微镜观察结果显示,经SARS-CoV-2假病毒感染的过表达血管紧张素转化酶2(ACE2)的A549细胞(A549-ACE2)中,转染ORF3a表达载体、ORF3b表达载体的A549-ACE2细胞组装和释放出的SARS-CoV-2假病毒颗粒量均高于未转染和空载转染的A549-ACE2细胞,差异有统计学意义(P<0.001),说明ORF3a和ORF3b可促进SARS-CoV-2假病毒颗粒的组装和释放;给予ploy(I∶C)刺激并转染ORF3a或ORF3b表达载体的A549细胞,其IFN-β相对表达量低于单纯给予ploy(I∶C)刺激的A549细胞,差异有统计学意义(P<0.001),说明ORF3a、ORF3b转染表达可显著抑制ploy(I∶C)诱导的IFN-β表达水平;Western blot检测结果显示,与单纯给予IFN-β处理相比,给予IFN-β联合ORF3a或ORF3b转染处理能够抑制干扰素信号通路中关键蛋白MyD88、TRAF6的表达水平;转染ORF3a、ORF3b表达载体的A549细胞中炎症因子(肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6)相对表达量均高于空载转染的A549细胞,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.001)。结论非结构蛋白ORF3能够促进SARS-CoV-2组装和释放,诱导宿主炎症应答,并抑制宿主干扰素表达。