PRRSV SD2株ORF5/ORF6基因克隆及双基因真核表达载体的构建

以PRRSV细胞培养物为模板,经RT-PCR扩增得到ORF5/ORF6基因,该产物和pIRES真核表达载体分别经双酶切,连接构建pIRES-ORF5/ORF6。经PCR、双酶切鉴定和测序证明成功构建了真核表达载体pIRES-ORF5/ORF6。测得的ORF5/ORF6序列与VR-2332株的氨基酸同源性分别为99%和100%,属北美洲型。

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5/ORF6基因重组鸡痘病毒的构建与小鼠免疫试验

本试验构建了1株表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)RF5/ORF6基因的重组鸡痘病毒,并进行了小鼠免疫实验,对其诱导BALB/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应的能力进行了评价。结果表明,重组鸡痘病毒能够刺激免疫鼠产生特异性PRRSV ELISA抗体,促进特异性T淋巴细胞增殖。对免疫小鼠血清中细胞因子检测结果表明,IFN-γ的分泌显著提高。结果表明,所构建重组鸡痘病毒可以对小鼠起到良好的免疫效果,具有成为抗PRRSV感染新型疫苗的潜力。

2006—2012年鲁豫冀地区15株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及ORF5/Nsp2基因的遗传变异分析

为研究鲁豫冀地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的遗传变异情况,对2006—2012年来自3省区发病猪场的42份样品进行PRRSV分离鉴定,并进行了生物学特性研究和PCR鉴定,结果显示先后分离到15株PRRSV。分别采用RT-PCR扩增其ORF5基因和部分Nsp2基因并测序,与GenBank中68个ORF5序列和40个Nsp2序列的推导氨基酸序列进行比对,遗传变异分析结果表明,15株分离株均属于美洲型毒株,其中13个毒株Nsp2基因推导的氨基酸序列均存在氨基酸的不连续缺失,其ORF5基因推导的氨基酸序列与JXA1株有较高的同源性(95.5%～97.5%);SDDY2007株与疫苗株RespPRRS MLV和VR2332株亲缘关系相近,处于同一个亚群中;而HN25-2009分离株Nsp2基因推导的氨基酸序列有30个氨基酸的特征性缺失,其ORF5基因推导的氨基酸序列的遗传进化分析结果显示该分离株处于VR2332所在亚群(氨基酸同源性97.5%),具有一定特殊性。本试验结果表明,2006—2012年高致病性PRRSV是鲁豫冀地区的优势流行毒株,且存在疫苗毒株,3省区流行毒株间有一定遗传差异,但无明显地域特征。

2016年-2017年广东省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为研究广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株ORF5基因的遗传演化情况,采用RT-PCR方法对2016年-2017年采自广东省地区猪场疑似PRRS猪肺脏组织样品中的PRRSV ORF5基因进行了扩增,并对这些毒株的核苷酸和氨基酸序列进行了生物信息学分析。结果表明,成功扩增出12株PRRSV流行毒株的ORF5基因片段。遗传演化分析表明,扩增出的毒株有10株与国内高致病性毒株亲缘关系较近,属于同一分支;2株与广东地区新报道的毒株QYYZ和GM2亲缘关系较近,属于同一分支。氨基酸序列比对结果表明,新分离的毒株在GP5抗原表位上存在广泛的变异。结果表明,该地区PRRSV毒株已经发生广泛变异。研究结果不仅揭示了广东地区流行的PRRSV ORF5基因的遗传演化特性,也为该地区PRRS的防控提供了科学依据。

猪生殖与呼吸综合征病毒HN6株ORF5基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR方法从河南分离的1株(HN6)猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸中扩增缺失N端疏水序列的基因片段dORF5(deleting ORF5),并将其克隆到pMD18-T载体中测序,再亚克隆到原核表达载体pET-32a上。重组质粒转化大肠杆菌BL21,用不同浓度IPTG分别于37℃诱导,经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白的分子质量约31.4 ku,薄层扫描分析显示,表达量占菌体总蛋白含量的28.8%。Western-blotting结果表明,重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。证实,该蛋白可用于PRRSV的诊断。

PRRSV云南A06株ORF5和ORF7基因的克隆与序列分析

设计2对引物分别扩增PRRSV的ORF5和ORF7基因,对从云南某猪场分离到的毒株A06进行RT-PCR检测,得到2条特异性扩增带,克隆至pMD18-T载体并测序。将A06株的ORF5和ORF7基因及其推断氨基酸序列分别与PRRSV欧洲型代表株LV、美洲型代表株VR2332和7株中国分离的美洲型毒株相应基因进行核苷酸和氨基酸序列比对分析。结果显示,A06株属于美洲型,其ORF5和ORF7基因及推断氨基酸与我国2006年分离的4株HP-PRRSV代表株的相似性高达98%～99%,与欧洲型代表株LV的相似性只有56%～64%。分别构建了以上毒株ORF5和ORF7基因的亲缘关系图谱,反映了A06株ORF5和ORF7基因的进化位置,完成2个基因的遗传变异分析。

2014年-2016年广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2和ORF5基因的遗传多样性分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传进化情况,对2014年-2016年来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2和ORF5基因的扩增和测序分析。结果获得34个Nsp2基因序列和45个ORF5基因序列,均属于美洲型毒株。Nsp2基因间核苷酸序列的同源性为91.8%~100%,与PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为81.3%~84.3%、88.9%~92.1%、94.3%~99.3%和73.5%~75.1%,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为51.5%~53.2%。ORF5基因间核苷酸序列的同源性为82.8%~100%,与PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为83.7%~99.5%、85%~95%、83.8%~99.7%和83.2%~86.4%,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为62.4%~64.5%。基于Nsp2和ORF5基因推导的氨基酸序列绘制的遗传进化树中,广西地区的毒株主要分布在以JXA1为代表的Ⅳ亚群。表明当前广西PRRSV流行毒株以JXA1株为代表的高致病性美洲型毒株为主,各毒株Nsp2和ORF5基因序列存在一定的差异,尚未发现欧洲型毒株和美洲型NADC30类毒株。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SD2株ORF5/ORF6双基因真核表达载体在哺乳动物细胞中的表达

为了实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF5和ORF6基因在同一质粒中分别表达各自编码的蛋白,发挥E蛋白的病毒中和优势和M蛋白的细胞免疫优势,将构建成功的pIRES-ORF5/ORF6转移载体用脂质体法转入稳定表达的细胞CHO,经G418加压筛选获得具稳定表达的细胞株。以RT-PCR、SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。结果表明:RT-PCR检测到两种目的基因的转录;SDS-PAGE和West-ern blot检测到同时表达的两种目的蛋白;间接免疫荧光检测到目的蛋白得到表达。

山东PRRSV流行株ORF5、ORF6、ORF7基因序列的分子特征

采用RT-PCR技术对2001-2007年分离自山东地区10株（ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7）猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）进行ORF5、ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,与已知序列的毒株的相应片段进行同源性分析比较,并对其分子特征进行分析。结果表明：该10株病毒仍属北美洲型,其中2001-2002年分离的SD1株、SD2株和2006年分离的SD6株核苷酸序列之间的ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为99.2%,99.8%,100%,均与北美洲原型代表株（VR-2332株）和疫苗毒MLVRe-spPRRS Repro USA遗传距离较近,同属一大分支;2006-2007年分离的PRRSV ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD3,SD4,SD5,SD7分离株ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为97.8%-100%,99.4%-99.8%,99.2%-99.7%,均与国内96年Ch-1a和2002年HB-1株及2006年分离鉴定的国内高致病性分离株（JXA1、Shanghai、HEB1）同属一个大的分支。首次证实目前山东省同时存在高致病性PRRSV和传统PRRSV,并且有由传统PRRSV向高致病性PRRSV演化的趋势。

2020—2022年闽粤赣地区PRRSV ORF5基因的分子流行病学调查

【目的】了解闽粤赣地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子流行动态,为该疫病的科学防控提供参考。【方法】采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对2020—2022年闽粤赣地区1475份临床猪组织和血清样品进行检测,对PRRSV阳性样品进行ORF5基因扩增和测序,并对ORF5基因的序列进行系统发育分析。【结果】2020、2021、2022年闽粤赣地区发病猪PRRSV的阳性率分别为24.23%(95/392)、27.69%(162/585)、18.07%(90/498),2020—2022年福建、广东、江西地区PRRSV的阳性率分别为23.20%(272/1172)、23.96%(52/217)、26.44%(23/87)。挑选来自不同猪场的86份阳性样品进行PCR扩增,成功获得62株PRRSV ORF5基因序列,并下载GenBank已发布的18株2020—2022年闽粤赣地区PRRSV的ORF5基因序列,与127株PRRSV国内外参考株ORF5基因序列构建系统发育树。系统发育树显示,80株闽粤赣PRRSV分离株均属美洲株。其中,40株分布在谱系1(NADC30-like株、NADC34-like株)上,12株分布在谱系3(GM2-like株、QYYZ-like株)上,7株分布在谱系5(VR2332-like株、BJ-4-like株)上,21株分布在谱系8(JXA1-like株、CH-1a-like株)上。对核苷酸和氨基酸序列的同源性进行分析,结果显示,80株PRRSV ORF5基因编码的核苷酸序列同源性为81.2%~100%,氨基酸序列同源性为78.6%~100%。33株PRRSV ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸序列在中和表位区第39氨基酸残基处存在变异。【结论】2020—2022年闽粤赣地区PRRSV流行株以谱系1为主(50.00%),并存在谱系1、3、5、8的混合流行。

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5/6/7基因真核载体的构建

针对PRRSV ORF5～ORF7设计3对特异性引物,以PRRSV GD-XH株和GD08-1株为模板进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,获得重组质粒pEGFP-N1-(ORF5～ORF7),然后将重组表达质粒转染Marc-145细胞.通过荧光显微镜观察显示,重组质粒pEGFP-N1-(ORF5～ORF7)和载体pEGFP-N1均有绿色荧光出现.结果表明:成功构建了表达PRRSV GD-XH株和PRRSV GD08-1株的GP5、M、N蛋白的真核表达质粒pEGFP-N1-GD-XH-GP、pEGFP-N1-GD-XH-M、pEGFP-N1-GD-XH-N、pEGFP-N1-GD08-1-GP5、pEGFP-N1-GD08-1-M、pEGFP-N1-GD08-1-N.

稳定表达PRRSV M蛋白的MARC-145^(ORF6)细胞系的构建及其对PRRSV增殖的影响

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该质粒连同辅助质粒共同转染至HEK293T细胞获得重组慢病毒;之后将重组慢病毒感染MARC-145细胞,利用嘌呤霉素结合有限稀释法进行筛选,连续筛选3轮后建立了稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系;并使用CCK-8试验评估过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞生长的影响。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光(IFA)评估MARC-145ORF6细胞系的传代稳定性并鉴定M蛋白的亚细胞定位,进一步利用RT-qPCR评估过表达M蛋白对MARC-145细胞的干扰素及相关调节基因的影响;此外,还测定了PRRSV在MARC-145ORF6细胞系、MARC-145Flag细胞系和MARC-145细胞中的病毒滴度并绘制多步生长曲线以比较其差异。CCK-8试验结果表明,过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞活力无显著影响;RT-qPCR、Westernblot和IFA等试验结果表明,MARC-145ORF6细胞系能够表达PRRSV的M蛋白且在传代过程中稳定。此外,稳定表达PRRSVM蛋白显著下调了细胞系的Ⅰ型干扰素及其相关调节基因;多步生长曲线表明,MARC-145ORF6细胞系促进PRRSV增殖,提高其病毒滴度。综上,本研究构建了可以稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系,发现其Ⅰ型干扰素水平显著下调且促进PRRSV复制。本研究构建的MARC-145ORF6细胞系将为M蛋白功能的深入研究提供重要生物材料。

猪繁殖和呼吸综合症病毒河南地方株ORF5/6基因的克隆及真核表达

应用RT-PCR方法分别扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)河南地方株的ORF5和0RF6基因。将扩增基因克隆入真核表达载体pcDNA3.0中,设计不同引物自行构建重组质粒PcDNA-ORF5、ORF6和pcDNA-ORF5/6。运用磷酸钙法将重组质粒分别瞬时转染293T细胞,经流式细胞和westbloting试验分析表明共表达重组质粒PcD-NA-ORF5/6表达蛋白能够与PRRSV的阳性血清发生特异性反应,而pcDNA-ORF5-ORF6在293T细胞很难检测到蛋白表达。该结果表明蛋白质生物活性和其蛋白质空间构象有一定关系,也为下一步进行构建PRRSV假型病毒来研究ORF5/6蛋白的结构与功能的关系奠定了基础。

2016-2017年江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及ORF5基因变异分析

为了解近年来江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)分子流行病学和其遗传变异情况,本次调查于2016-2017年从江西省各地区规模化猪场采集453份疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病料,采用RT-PCR方法对所有病料进行检测。结果发现,其中321份病料为PRRSV阳性,阳性率为70.86%,各地区的阳性率在19.15%~84.85%之间。挑选14份阳性样品测序后,经ORF5基因序列分析,江西地区各PRRSV毒株ORF5基因的核苷酸同源性为83%~100%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性在59.9%~98.5%之间。基于ORF5基因的进化树分析表明,14个测序毒株均为美洲型毒株,其中有4株为基因亚型Ⅰ,即高致病性毒株(HP-PRRSV);3株为基因亚型Ⅱ,即经典毒株;3株为基因亚型Ⅲ,即NADC30-like毒株;4株为新出现的基因亚型Ⅳ。氨基酸序列比对分析表明,基因亚型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ毒株ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸在3个表位及2个重要的抗原相关区域存在较大变异,其中以NADC30毒株为代表的基因亚型Ⅲ毒株和以GD1404毒株为代表的基因亚型Ⅳ毒株均表现出独有的氨基酸变异,这些变异可能会影响GP5蛋白的免疫原性。本次调查结果表明,2016-2017年江西地区PRRSV流行出现了新形势,美洲型毒株出现了多基因亚型共同存在的局面,以高致病性毒株(HP-PRRSV)为主,NADC30-like毒株和新基因亚型等新毒株的比例较高,同时还存在经典毒株;持续实时监测PRRSV的毒株流行和变异情况,可为临床诊断、药物和疫苗开发及PRRS的科学防控提供依据。

2016～2017年四川地区PRRS病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解四川地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传进化情况,本试验对2016～2017年四川地区的12份PRRSV阳性样本的ORF5基因进行了测序及遗传进化分析。结果显示:12个样本毒株的ORF5基因的核苷酸序列同源性为82.3%～99.8%,推导的氨基酸同源性为81.1%～99.5%,与美洲型和欧洲型代表毒株的核苷酸序列同源性分别为82.8%～99.5%和61.4%～64.6%。氨基酸序列比对结果表明在抗原表位区域存在氨基酸变异;进化分析表明12个毒株均属于美洲型,其中10株属于JXA1-like亚群,1株属于NADC30亚群、1株属于QYYZ亚群。

2006～2008年重庆部分区县PRRSV分离株ORF5和Nsp2基因的遗传变异分析

为了解重庆市PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2006-2008年分离到的14株重庆市内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和ORF5基因序列的测定和分析。结果显示,与2006年以来国内流行的变异毒株相比,Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到97.3%-99.5%和98.2%-99.7%,这2个基因推导的氨基酸序列同源性分别达到95.7%-99.2%和98.0%-99.5%。与传统毒株相比,Nsp2和ORF5基因及其推导的氨基酸都存在点突变,并在Nsp2基因内部存在编码30个氨基酸的碱基对的不连续缺失,ORF5基因未存在缺失。从遗传进化以及变异情况看,重庆市流行的PRRSV主要为变异毒株,属于美洲型中的亚群Ⅱ。

人类疱疹病毒8型ORF50基因截短片段和vIL-6全长基因的克隆、表达及表达产物的纯化

目的:克隆人类疱疹病毒8型(human herpesvirus 8,HHV-8)ORF50截短基因和编码病毒IL-6(vIL-6)全长基因,将其置于大肠杆菌中作融合表达,并纯化融合表达的vIL-6。方法:分别以本实验室先前构建的重组质粒pcDNA3.1+ORF50和pcD-NA3.1+vIL-6为模板,PCR扩增目的基因片段,克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建含HHV-8ORF50截短基因的重组原核表达质粒pORF50-C1,pORF50-C2,pORF50-C3和含vIL-6全长基因的重组原核表达质粒pvIL-6。重组质粒经酶切鉴定和核酸序列测定正确后转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。用glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化vIL-6表达产物。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western blot检测GST融合蛋白的表达和纯化情况。结果:核酸序列分析的结果表明,克隆的序列与基因数据库中已登记的HHV-8相应序列呈现100%同源;IPTG诱导后的菌体,经SDS-PAGE,显示有相应大小的融合表达蛋白产生。Western blot亦在预期的位置检测到特异性条带。结论:在E.coli中获得了正确表达的HHV-8ORF50基因3个截短片段和vIL-6全长基因,并成功纯化了vIL-6融合蛋白。

2016-2017年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子检测及NSP2、ORF5基因变异分析

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在广东流行毒株的分子遗传变异情况和发展趋势,通过RT-PCR方法,对2016-2017年采自广东省各地906份疑似病料进行PRRSV检测,并对其中9株PRRSV的NSP2和ORF5基因进行测序及遗传变异分析。结果显示,有399份样品被检出为阳性,阳性率达到44%;通过NSP2和ORF5基因序列比对和遗传进化分析,发现广东流行毒株主要为美洲型PRRSV,且全部9株与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)高度同源;其中7株的NSP2蛋白存在与HP-PRRSV相同的1+29个氨基酸的不连续缺失特征;9株GP5蛋白的2个重要抗原相关区域的氨基酸位变化特征与HP-PRRSV一致,与美洲型代表株VR-2332相比变异明显。结果表明,PRRSV在广东流行的情况仍比较严重,当前HP-PRRSV依然是广东的优势病毒株,提示对PRRSV的流行和变异进行持续监测是有必要的,还应加强对其致病机理和新型疫苗研发等的深入研究。

2015-2016年北方某省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因遗传变异分析

为了解北方某省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2015-2016年省内各地163家养殖场的874份PRRS疑似病料进行RT-PCR检测,并对PRRSV阳性样品的ORF5基因进行测序及变异分析。结果显示,PRRSV阳性样品共209份,阳性率为23.9%。扩增阳性样品的ORF5基因序列,并选取44条有代表性的基因序列,遗传进化分析表明,北方某省PRRSV流行毒株为美洲型毒株,其ORF5基因核苷酸同源性为82.6%~99.5%,与VR-2332、CH-1a、HuN4和JXA1、CHsx1401和NADC30株的核苷酸同源性分别为83.5%~99.3%、85.1%~95.2%、83.5%~99.3%和82.4%~96.8%。基于ORF5基因核苷酸序列绘制的遗传进化树显示,目前北方某省流行的美洲型PRRSV可分为4个亚群,其中24株属于以CHsx1401和NADC30为代表的Ⅱ亚群,19株属于以HuN4和JXA1为代表的Ⅳ亚群,1株属于以VR2332为代表的Ⅰ亚群。各毒株ORF5基因序列之间存在一定差异,但无明显地域性。本研究结果可为北方某省PRRSV遗传进化研究和疫病防控提供参考。

高致病性PRRSV的分离及其Nsp2和ORF5基因的序列分析

从广东省不同地区疑似高致病性猪生殖与呼吸综合征病料中分离出能引起Marc-145细胞病变的病毒，经RT-PCR检测，确定分离物中存在美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），将此细胞病毒液命名为GDBl，用其感染回归5头40日龄健康仔猪，采集发病及死亡猪组织，重新用Marc-145细胞进行病毒分离，将再次分离到的病毒命名为GDB1F。对GDB1、GDBIF的Nsp2、ORF5基因序列进行测定分析。结果表明，单独感染猪2／2发病死亡，同居感染的3头猪全部发病，2头死亡；感染后2～4d所有感染猪均出现体温升高。死亡猪表现为严重的出血性、间质性肺炎，肢体远端皮表出血。序列分析结果表明，GDB1和GDB1F株的Nsp2基因与国内高致病性PRRSV分离株JXA1、HN2Nsp2、HNXT1、HNyz、HUB2、HUN1的同源性很高，达98．4％～99．0％。GDB1和GDB1F株的ORF5基因存在部分突变，没有缺失，与国内高致病性PRRSV分离株JXA1、HUB2、JX0612、GDZC1的同源性高达97．5％～99．8％。