稳定表达PRRSV ORF5-ORF6融合基因重组减毒猪霍乱沙门菌的构建及其生物学特性

为构建能稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5-ORF6融合基因的重组减毒猪霍乱沙门菌,以p MD19-T-ORF5-7为模板,PCR分别扩增出ORF5和ORF6,将2个基因先后插入表达载体PYA3493,构建了重组质粒PYA3493-ORF5-ORF6。PCR、双酶切及测序结果表明,成功构建了重组质粒p YA3493-ORF5-ORF6。将该重组质粒电转至减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1基因缺失株,获得PRRSVORF5-ORF6融合基因重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6),并对该重组减毒猪霍乱沙门菌的生长特性、遗传稳定性和表达特性进行了测定。进一步对重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6)研究发现,其生长速度比强毒株C78-1明显减慢,与ΔcrpΔcyaΔasd C78-1缺失株及ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)互补菌株基本一致。在体外连续传代能够稳定遗传ORF5-ORF6融合基因。重组菌培养上清经SDS-PAGE能检测到ORF5-ORF6蛋白条带,且经Western-blot分析证实,重组菌共表达的GP5和M蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合。以上结果表明,能稳定携带ORF5-ORF6融合基因的重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6)构建成功,为开发猪繁殖与呼吸综合征和仔猪副伤寒基因工程二联疫苗奠定了良好基础。

山东PRRSV流行株ORF5、ORF6、ORF7基因序列的分子特征

采用RT-PCR技术对2001-2007年分离自山东地区10株（ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和SD7）猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）进行ORF5、ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,与已知序列的毒株的相应片段进行同源性分析比较,并对其分子特征进行分析。结果表明：该10株病毒仍属北美洲型,其中2001-2002年分离的SD1株、SD2株和2006年分离的SD6株核苷酸序列之间的ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为99.2%,99.8%,100%,均与北美洲原型代表株（VR-2332株）和疫苗毒MLVRe-spPRRS Repro USA遗传距离较近,同属一大分支;2006-2007年分离的PRRSV ShanDong-3、SD-JN、SD-ZQ、SD3,SD4,SD5,SD7分离株ORF5、ORF6、ORF7同源性分别为97.8%-100%,99.4%-99.8%,99.2%-99.7%,均与国内96年Ch-1a和2002年HB-1株及2006年分离鉴定的国内高致病性分离株（JXA1、Shanghai、HEB1）同属一个大的分支。首次证实目前山东省同时存在高致病性PRRSV和传统PRRSV,并且有由传统PRRSV向高致病性PRRSV演化的趋势。

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5/ORF6基因重组鸡痘病毒的构建与小鼠免疫试验

本试验构建了1株表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)RF5/ORF6基因的重组鸡痘病毒,并进行了小鼠免疫实验,对其诱导BALB/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应的能力进行了评价。结果表明,重组鸡痘病毒能够刺激免疫鼠产生特异性PRRSV ELISA抗体,促进特异性T淋巴细胞增殖。对免疫小鼠血清中细胞因子检测结果表明,IFN-γ的分泌显著提高。结果表明,所构建重组鸡痘病毒可以对小鼠起到良好的免疫效果,具有成为抗PRRSV感染新型疫苗的潜力。

共表达与牛疱疹病毒1型VP22融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒E及M蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其免疫原性观察

为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因工程疫苗,以伪狂犬病毒(PRV)gE基因缺失标志疫苗株TK-/gE-/LacZ+为病毒载体,通过同源重组,构建了共表达与牛疱疹病毒1型VP22(BHV-1 VP22)融合的PRRSV E及M蛋白的重组伪狂犬病毒(rPRV)TK-/gE-/VP22E+/VP22M+。经PCR、Southern blot、Westernblot证实rPRV构建正确,并能表达与BHV-1 VP22融合的PRRSV E及M蛋白。rPRV在IBRS-2、PK-15细胞中的增殖滴度与PRV亲本株相比无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV增殖。用该rPRV免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠抗PRRSV中和抗体及脾淋巴细胞增殖反应,并与未融合VP22的单表达PRRSV E蛋白及共表达E及M蛋白的rPRV TK-/gE-/E+与TK-/gE-/E+/M+进行比较。结果显示TK-/gE-/VP22E+/VP22M+可诱导小鼠产生更好的体液与细胞免疫反应,BHV-1 VP22发挥了佐剂效应。本研究为研制安全、有效的猪繁殖与呼吸综合征-伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了基础。

猪生殖与呼吸综合征病毒多基因重组真核表达质粒的构建及诱导的小鼠体液免疫

根据猪生殖与呼吸综合征病毒已知序列设计了3对引物,采用RT-PCR方法分别扩增ORF3、ORF5和ORF6基因,并将其依次与真核表达质粒pcDNA4.0定向连接,构建了重组质粒pcDNA4.0-ORF6-ORF3-ORF5,经提纯后,给试验组小鼠后肢胫前肌注射,每只100μg,2周后再注射1次。首免后每隔7 d采血1次,用间接ELISA检测血清抗体水平并测定其中和抗体水平。结果显示,所构建的重组质粒能够诱导小鼠产生很高的ELISA抗体和中和抗体水平。

山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子特征

为揭示2009~2010年山东地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的分子特征,通过RT-PCR扩增采自山东地区不同猪场病猪组织样本中PRRSV的Nsp2、ORF5、ORF6、ORF7序列,用DNAStar软件分析所测序列,并与北美洲型VR-2332株、欧洲型LV株及国内分离株进行核苷酸和推导的氨基酸同源性比较。结果表明,Nsp2、ORF5、ORF6、ORF7核苷酸与北美洲型VR-2332的同源性分别为77%~79.9%、88.3%~89.6%、94.9%~95.8%、93.3%~94.1%,与欧洲型LV株的同源性分别为29.6%~31.6%2、64.1%~64.8%、68.3%~68.6%、66.2%~67.3%,证明山东地区的PRRSV毒株仍属北美洲型。系统进化分析表明它们与国内2006~2010年间的分离株（变异株）亲缘关系较近,而与更早的分离株和疫苗MLV株亲缘关系较远,未发现传统毒株。在Nsp2、ORF5、ORF6、ORF7基因上均有不同程度的点突变。本研究揭示了山东地区流行的PRRSV各基因的变异特征,为PRRSV的综合防控提供理论依据。