牦牛C1H21orf62基因的克隆、生物信息学及表达分析

应用RT-PCR方法克隆牦牛C1H21orf62基因并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR方法检测C1H21orf62基因在有角牦牛和无角牦牛角芽组织的m RNA表达。结果表明,C1H21orf62基因编码区全长662 bp,编码161个氨基酸。C1H21orf62是一种亲水性蛋白,含有13个潜在的磷酸化位点,但无跨膜域和信号肽。C1H21orf62基因m RNA在无角牦牛角芽组织的表达水平极显著高于有角牦牛。

C17orf62诱导细胞死亡的作用及其机制

目的:克隆功能未知的人类新基因C17orf62的长编码序列(C17orf62-L),分析其在细胞系中的表达情况,研究其在细胞内定位情况及其对细胞活力的影响。方法:利用GenBank中的数据,通过聚合酶链反应(polymerasechain reaction,PCR)从人的cDNA文库中克隆C17orf62编码187个氨基酸的长编码序列C17orf62-L,运用生物信息学分析其结构特性。通过逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)分析C17orf62在细胞系中的表达情况。经激光共聚焦显微镜观察C17orf62-L的亚细胞定位情况。使用流式细胞检测以及Western blot实验,分析C17orf62-L对细胞活力的影响及其机制。结果:生物信息学分析显示,C17orf62-L具有信号肽切割位点并包含跨膜结构域。RT-PCR证明C17orf62-L在多种细胞系广泛表达;激光共聚焦实验证实,C17orf62-L广泛分布于胞质,并且与高尔基体部分共定位。功能分析发现,C17orf62-L可诱导细胞死亡,且可通过多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)切割发挥作用。结论:C17orf62是一个新的人类细胞死亡诱导基因。

水痘-带状疱疹病毒疫苗株ORF62碱基突变及ORF62编码IE62反式激活力的分析

目的分析水痘-带状疱疹病毒（VZV）疫苗株（vOka）ORF62碱基突变及ORF62编码即刻早期蛋白（IE62）对VZV基因启动子的反式激活力。方法分别以vOka及其亲本株（pOka）基因组DNA为模板，PCR扩增获得ORF62全序列，克隆到高效表达质粒pCAGGS中构建vOka和pOkaORF62表达质粒；采用双脱氧核苷酸链末端终止法对表达质粒中ORF62测序；应用基因转染瞬时表达技术比较vOka和pOkaIE62在MeWo和CV1细胞中对VzV基因启动子的反式激活力差别。结果成功构建vOka和pOkaORF62表达质粒pCAG-vOka62和pCAG-pOka62；测序结果发现，与pOka比较，vOkaORF62至少有9个碱基突变，其中106262、107136和107262位点碱基突变后分别产生SmaⅠ、BssHⅡ和NaeⅠ酶切位点。vOka IE62在MeWo细胞中对ORF4、ORF10和ORF61启动子的反式激活力低于pOka IE62，但在CV1细胞中对ORF9启动子的反式激活力高于pOka IE62。结论利用vOkaORF62碱基突变产生的酶切位点可鉴别vOka和pOka，vOka和pOkaIE62对VZV基因启动子的反式激活力差别可能与转染细胞类型有关。

水痘带状疱疹病毒野毒株和疫苗株区分方法研究

目的:建立水痘带状疱疹病毒野毒株和疫苗株的聚合酶链反应和限制性片段多态性(PCRRFLP)区分方法。方法:对疫苗株和水痘临床患者疱疹液进行开放阅读框62(ORF62)区基因序列测定,确定可用于野毒株和疫苗株区分的单核苷酸的多态性(SNP)位点。PCR扩增含SmaⅠ、Bss HⅡ和NaeⅠ酶切位点的基因(DNA)片段后进行限制性内切酶酶切,利用酶切图谱区分野毒株和疫苗株。结果:用PCR-RFLP分析疫苗株和疱疹液,疫苗株酶切图谱为SmaⅠ^+Bss HⅡ^+NaeⅠ^+,疱疹液酶切图谱为SmaⅠ^-Bss HⅡ^-NaeⅠ^-。结论:基于ORF62区的106262(SmaⅠ)、107136(Bss HⅡ)、107252(NaeⅠ)的PCR-RFLP可有效区分野毒株和疫苗株。

国产水痘减毒活疫苗关键基因的序列分析和比较

目的从基因水平分析国产水痘减毒活疫苗的安全性和一致性。方法对国内4家企业生产的水痘减毒活疫苗的关键基因(ORF38、ORF54和ORF62)进行PCR扩增和序列测定,并与Genbank公布的Dumas、P-Oka、V-Oka及国外上市疫苗Varilrix(GSK)、Varivax(Merck)的序列进行比对。结果 4家国产水痘减毒活疫苗的ORF38和ORF54区基因序列一致,并且同V-Oka、Varilrix完全一致,与Varivax(Merck)有1处差异。4家国产水痘减毒活疫苗的ORF62区基因序列基本一致,与V-Oka、Varilrix(GSK)和Varivax(Merck)均存在个别核苷酸差异。结论 4家国产水痘减毒活疫苗的ORF38、ORF54和ORF62区基因序列基本一致,稳定性较好,与V-Oka、Varilrix(GSK)和Varivax(Merck)存在较小差异,没有引入新的突变位点。

荧光定量PCR技术用于快速检测水痘-带状疱疹病毒的研究

目的:建立特异、灵敏、高效的TaqMan荧光定量PCR方法用于水痘-带状疱疹病毒(VZV)的快速检测。方法:从GenBank下载几十株VZV基因序列进行同源性比对,选取高度保守区ORF62(编码即刻早期蛋白IE62)设计荧光定量PCR引物和TaqMan探针,并对反应体系与反应条件进行优化,同时验证方法的特异性、敏感性和重复性。结果:本方法对VZV的检测具有高度特异性,与肠道病毒EV71型,柯萨奇A、B组,麻疹病毒,风疹病毒,流感病毒以及相关腺病毒B、C组等均无交叉反应;检测灵敏度达36 copies/μl;反应体系具有很高的稳定性;整个操作过程仅需3 h～4 h。采用该方法对9份疑似VZV患者标本进行检测均为阳性,检测灵敏度明显高于病毒分离法、普通PCR法。结论:本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、高效,适用于VZV早期感染病例的快速确认以及暴发疫情的应急诊断中。

水痘疫苗接种后突破性病例病毒分子生物学分析

水痘是由水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV）原发感染引起的一种儿童常见的、以全身疱疹并常伴有发热为特征的高度传染性疾病。接种水痘疫苗是预防水痘感染的惟一手段,1974年水痘疫苗首先在日本上市,我国于1998年开始接种。水痘减毒活疫苗是将水痘病毒Oka株（v-Oka）在MRC-5二倍体细胞培养而获得的,Oka株是当今世界广泛应用的疫苗毒种。