驴源马疱疹病毒8型的分离鉴定与生物信息学分析

本研究旨在分离1株驴源马疱疹病毒8型(Equine herpesvirus type 8,EHV-8)毒株并分析其遗传特征。从山东省聊城地区某驴场采集病驴肺脏组织,经PCR方法鉴定EHV-8的感染情况;对EHV-8感染阳性的肺组织进行研磨,经反复冻融后接种于兔肾细胞(RK-13)细胞中,盲传3代,待出现细胞病变(CPE)时收集细胞,并通过PCR、间接免疫荧光试验、透射电镜等技术对EHV-8进行鉴定。利用PCR扩增获得分离株的ORF 70全基因组序列,并进行生物信息学分析。研究结果显示,经PCR鉴定获得EHV-8感染阳性的肺脏组织,病料接种易感细胞RK-13后出现典型CPE,分别收集前3代的细胞培养物,经PCR扩增,均获得与预期大小一致的ORF 70基因片段,将分离获得的EHV-8毒株命名为SDLC66,序列上传GenBank,获得登录号:MW816102。经测序和序列比对发现,SDLC66毒株与AHV-3毒株(GenBank登录号:U24184.1)ORF 70基因的相似性为99%,与国内的EHV-8 wh毒株(GenBank登录号:JQ343919.1)、国外EHV-8/IR/2015/40(GenBank登录号:MF431614.1)、EHV-8/IR/2003/19(GenBank登录号:MF431611.1)参考毒株的相似性最高,均为99.8%。经遗传进化树分析发现,SDLC66与EHV-8(EHV-8 wh、EHV-8/IR/2015/40和EHV-8/IR/2003/19株)在一个小分支上,亲缘关系最近;与EHV-1型参考毒株(Hong Kong/57/1984、United Kingdom/32/1982、Oxfordshire/206/2013株)序列来源于同一大分支,亲缘关系较近,与EHV-4毒株(91c1和TH20p株)亲缘关系较远。间接免疫荧光试验可见与病毒蛋白特异结合的红色荧光信号;透射电镜观察可见直径约110 nm的圆形病毒粒子,并且核衣壳外有一层亮晕,亮晕外有一层囊膜。说明本试验成功分离得到1株驴源EHV-8毒株,为进一步研究其致病性和致病机制奠定基础。