基于EBNA1和oriP的载体在基因治疗中的应用研究进展

非病毒载体用于基因治疗的主要问题是导入靶细胞的效率较低,目的基因表达水平低,疗效持续时间也较短。EBNA1和oriP元件使引入该元件的质粒在真核细胞内保持为游离体、转运入核、转录增强。质粒携带的目的基因能够获得较高的转染效率,高水平、持续的表达。基于EBNA1 oriP的质粒在肿瘤、单基因缺陷先天性疾病、TNF相关的炎性疾病的基因治疗中显示了良好的应用前景。EBNA1 oriP元件用于构建人工染色体,携带目的基因的调控序列,可望实现可调控的基因治疗。

靶向EBV阳性鼻咽癌小环质粒的构建及表达

目的构建表达人IFNγ的靶向小环质粒及其对照质粒,并观察其在EBV阳性鼻咽癌细胞中的靶向表达。方法采用分子克隆的方法构建中间靶向质粒p SP72-ori P-IFNγ-poly A(p SP72-ori P-IFNγ)和对照质粒p SP72-CMV-IFNγ-poly A(p SP72-CMV-IFNγ)。对其分别做双酶切,定向克隆于母环质粒p2ФC31中,构建成p2ФC31-ori P–IFNγ和p2ФC31-CMV-IFNγ质粒。转化TOP10细菌后,通过介导分子内重组,降解原核骨架,获取只含目的基因表达盒的靶向小环质粒mc-ori P-IFNγ和对照质粒mc-CMV-IFNγ。将小环质粒分别转染EBV阴性细胞和EBV阳性细胞,采用ELISA方法定量检测小环质粒介导目的基因的靶向表达。结果构建了靶向性母环质粒p2ФC31-ori P–IFNγ及其对照质粒p2ФC31-CMVIFNγ,并诱导纯化出相应的靶向性小环质粒mc-ori P-IFNγ及其对照质粒mc-CMV-IFNγ,通过转染真核细胞,检测出靶向性小环质粒能够介导IFNγ在EBV阳性鼻咽癌细胞中特异表达。结论成功构建了靶向性小环质粒mc-ori P-IFNγ,并证明其能够特异性地介导目的基因在EBV阳性鼻咽癌细胞中表达,而在EBV阴性鼻咽癌细胞及正常细胞中不表达。

载体介导无遗传物质整合的诱导性多能干细胞的生成

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)因其具有类似胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)的"自我更新"和分化潜能而成为生物学和医学等领域的研究热点之一。但是,目前i PSCs的生成主要以逆转录病毒或慢病毒为载体,而病毒载体和外源性重编程因子在受体细胞基因组中的整合,使得i PSCs存在致瘤性的安全隐患。同时,采用无载体介导的方法如重组蛋白、小分子物质的重编程效率较低。为此,目前已成功开发一些载体和方法可以介导无外源性遗传物质整合的i PSCs的生成。该文就整合后可删除的基因表达载体(Cre/lox P重组系统、piggy Bac转座子/转座酶系统)和非整合基因表达载体(ori P/EBNA1附加型载体、微环DNA载体)在i PSCs生成上的应用研究作一综述,以期为i PSCs的临床安全应用提供理论和技术参考。

国际征税领域中数字经济方向热点问题与应对动向

目前,以经合组织和欧盟为中心,正在进行一些讨论,其内容主要涉及防止跨国公司参与税收流失,其中包括一项引入适合于数字经济常设机构新概念的计划。2018年3月,经合组织和欧盟发布了数字经济税收计划短期和长期临时报告,其中讨论了基于常设机构新概念的公司税,如作为长期措施的"重大的数字存在",并讨论了作为短期措施的"数字服务税"的引入计划。每个国家的短期措施包括英国的DPT、ORIP和DST,澳大利亚的MAAL和类似于英国DPT的DPT。采取规避方式侵蚀英国税收的业务在英国的DPT中应当纳税。ORIP对在英国销售商品或服务的低税率国家的离岸公司的无形资产的收入征收所得税。DST正在对数字服务征税,纳税收入产生于在英国参与该服务的用户。澳大利亚的旁路利润税是在两种应税类型按每种分类法分开后,通过英国的DPT确定基准点按顺序引入的。2016年1月,首次引入常设机构反避税制度MAAL;2017年7月,引入DPT,以防止利用缺乏经济实质的交易进行避税。数字经济下的短期国家措施,如DPT,可以被视为针对具体案例的"TAARs"。同时,还需要关注,在短期措施下,可能与税务条约发生冲突,并可能与其他国家的新型税收措施发生税务纠纷。DPT的实施,使其成为一种强化相关企业间转移价格税收的措施,从目的和效果上都有利于税务机关。考虑到各国对长期措施的建议,具体来看:英国的建议很可能违反税收中性原则,只将税收关系和利润分割法应用于数字业务领域;而美国建议的不足则体现在无形财产销售的概念不明确。由于各国对相关公司的判断标准和偏好不同,预计德国和法国的建议难以达成一致,并且建议中的很多原则缺乏具体的细节也成为一个主要问题。同时,鉴于这是一项一般的BEPS措施,也有人质疑这项措施是否适合作为数字经济的长期措施。考虑到数字经济的税收问题源于税收关系,G24的建议被认为在方法上最具有合理性。同时,在2020年准备好后续报告之前,DPT等短期国家措施可能会作为临时性基础措施而实施,以支持BEPS项目的实施并解决悬而未决的问题。