U-2 OS细胞/CCK-8法测定1型单纯疱疹病毒溶瘤活性

目的:建立U-2 OS细胞/CCK-8比色法,用于测定1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)溶瘤活性。方法:选择3株对HSV-1敏感的的细胞株,在细胞培养板上以梯度浓度的HSV-1感染一定时间后,加入CCK-8进行显色,用酶标仪检测后采用四参数曲线法进行量效关系拟合。在选择出量效关系最好的细胞株基础上,对方法的各项实验条件进行优化,并采用活性测定标准品对结果进行校正分析。对建立的方法初步验证准确性和精密度,并用上述方法对3批样品的溶瘤活性进行检测。结果:优化后的实验采用U-2 OS细胞株,1∶4的样品系列稀释比例,5×10^4 PFU·mL^-1的样品系列稀释初始浓度,每孔2.5×10^4个细胞的铺板数量,72 h感染时间和4 h CCK-8试剂反应时间等条件进行样品测定,得到的四参数方程拟合的量效关系曲线R^2大于0.99,信噪比较高,初步验证结果显示该方法的回收率为113.4%,日间精密度分析的几何变异系数(GCV)为21.8%。3批测试样品的溶瘤活性分别为3.52×10^3、3.93×10^4和1.61×10^5 U·mL^-1。结论:建立的U-2 OS细胞/CCK-8法可用于以HSV-1为载体的基因治疗药物溶瘤活性测定。

CCK-8法评价口腔粘结材料的体外细胞毒性研究

目的:CCK-8法评价口腔粘结材料的体外细胞毒性研究。方法:应用CCK-8比色法比较体外4种粘结材料(普通型玻璃离子、加强型玻璃离子、SuperBond C&B及SE BOND)对人牙周膜成纤维细胞(human periodontalligament cell,HPDLC)的细胞毒性,初步探讨4种粘结材料的生物学性能。结果:4种粘结材料对HPDLC的生物相容性影响结果相似,其中普通型玻璃离子及SuperBond C&B无细胞毒性,加强型玻璃离子具极轻微细胞毒性,SE BOND具轻微细胞毒性。结论:4种粘结材料均满足口腔材料临床应用的生物相容性要求。

CCK-8法与MTT法检测人前列腺癌PC3细胞活性的比较研究

目的探讨CCK-8法和MTT法的最佳实验条件。方法以人前列腺癌PC3细胞作为研究对象,采用CCK-8和MTT法检测抗肿瘤药物阿霉素(ADM)对PC3细胞增殖的影响。结果 CCK-8法的最佳检测波长为450 nm,最佳检测时间为加入CCK-8试剂后4 h,适宜细胞数量范围为8×102～1×105个。结论 CCK-8法较MTT法检测的灵敏度高,准确性好,是一种优于MTT法的检测细胞增殖活性的方法。

CCK-8法检测兔筋膜成纤维细胞增殖活性之最佳测试条件研究

目的研究CCK-8法检测兔筋膜成纤维细胞(RFFBs)增殖活性的最佳测试条件。方法以兔筋膜作为成纤维细胞原代培养组织,利用传代至P3的成纤维细胞,对比CCK-8法在不同孵育时间及不同检测波长条件下吸光光度值的差异,研究CCK-8法检测兔筋膜成纤维细胞增殖活性的最佳检测时间及最佳检测波长。结果 CCK-8法检测兔筋膜成纤维细胞增殖活性的最佳检测时间为加入CCK-8试剂孵育后的4 h,最佳检测波长为450 nm。结论 CCK-8法在孵育4 h后及酶标仪450 nm波长下检测兔筋膜成纤维细胞的灵敏度最高。

CCK-8法检测药物影响肿瘤细胞增殖的优化研究

目的通过优化CCK-8的实验条件,提高检测药物影响肿瘤细胞增殖的敏感性和可靠性。方法以人肺癌A549细胞和白血病Molt-4细胞为研究对象,CCK-8法和MTT法分别检测细胞增殖的变化,并与Coulter细胞计数法和克隆形成率法进行比较。结果在相同的细胞数下,CCK-8法的检测灵敏度明显高于MTT法。以细胞密度1 000个/孔接种,抗肿瘤药物多柔比星处理96 h后,CCK-8法检测到的变化与克隆形成率法相当。分析Molt-4悬浮细胞发现:CCK-8法与Coulter细胞计数法的检测灵敏度无明显差异(P>0.05)。结论优化实验条件后,CCK-8法是一种灵敏度高、可靠性良好的细胞增殖检测方法。

CCK-8法定量检测亚甲蓝对人髓核细胞的毒性

背景:前期细胞实验研究发现亚甲蓝确实对人髓核细胞具有毒性作用,且与药物浓度呈正相关,但是其毒性的临界范围未进行研究。目的:使用CCK-8法定量测定亚甲蓝对髓核细胞毒性作用的临界范围值。方法:选取1例椎间盘突出症患者的术后废弃髓核组织,提取髓核细胞,培养1代后制作细胞悬液,分9组接种到96孔板,空白对照只有培养基、CCK-8溶液而没有细胞;0加药对照组只有培养基、细胞和CCK-8溶液;其余7个加药组分别加入1%,0.5%,0.1%,0.05%,0.01%,0.005%,0.001%浓度的亚甲蓝干预细胞生长繁殖。在培养24,48,72,96 h后使用CCK-8法测定吸光度,计算细胞活力并观察每一组颜色变化。结果与结论:(1)颜色变化:0加药对照组颜色最深,加药组颜色与药物浓度负相关,且0.05%、0.01%、0.005%、0.001%组颜色较深并与0加药组颜色接近;(2)各组吸光度值均数及细胞活力:与0加药组相比,1%组吸光度减小(P<0.05),1%与0.5%组比较差异均无显著性意义(P>0.05),0.1%组吸光度及细胞活力显著高于0.5%组,0.05%组显著高于0.1%组;(3)结论:亚甲蓝对人髓核细胞具有细胞毒性,毒性临界值在0.1%-0.05%之间且靠近0.05%,确切值还有待于进一步研究。

CCK-8法测定纤维蛋白胶对人脂肪干细胞的细胞毒性

目的探讨CCK-8法测定纤维蛋白胶对人脂肪干细胞的细胞毒性。方法选取2018年11月12日来我院进行成人吸脂术的某位28岁健康女性的术后废弃脂肪组织,并从中得到人脂肪干细胞,分别制成50%浸提液组、100%浸提液组、阴性对照组、阳性对照组,采用CCK-8检测试剂盒测定各组纤维蛋白培养液中的吸光值。结果原代脂肪干细胞(ASCs)生长缓慢,传代后生长加速,且脂肪干细胞呈成纤维样细胞形态;阴性对照组的吸光值与50%、100%形态放置24h和72h的纤维蛋白胶浸提液组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。50%及100%纤维蛋白胶浸提液组、阴性对照组的吸光值均小于阳性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论纤维蛋白胶在与脂肪干细胞相混合的情况下无显著细胞毒性,能够为探索基于纤维蛋白胶作为支架材料的有关脂肪结构提供参考。

MTT法和CCK-8法检测人肝癌细胞活性的对比研究

目的对比分析MTT法和CCK-8法检测人肝癌细胞活性的准确性。方法:同时采用MTT法和CCK-8法检测顺铂浓度在0.05、0.5、5umol/L时,肝癌细胞的致死率。结果:MTT法检测的偏大较大,而CCK-8法始终保持较小的偏差,CCK-8法要比MTT法更为准确,且存在统计学差异显著(P<0.05)。结论:CCK-8法检测肝癌细胞优越于MTT法,可以在检测其他细胞增殖上推广应用。

实时无标记细胞分析（RTCA）与CCK-8方法条件下LPS对奶牛乳腺上皮细胞增殖的比较分析

无标记细胞分析法(RTCA)与CCK-8法,可用于奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)活性监测。本研究选择RTCA和CCK-8两种方法,在0、5、10、20ng/μL4种不同浓度LPS条件下,研究LPS对MAC-T增殖的影响。结果表明,RTCA和CCK-8法均在不同浓度LPS条件下使MAC-T活力下降,均在浓度20ng/μL、时间6h时,下降最为明显。但相比之下,CCK-8法在定点测定时有局限性,而RTCA方法可以不间断、无标记和实时监测细胞贴壁、迁移和增殖的动态等生物反应过程,观察效果更加直观、准确,可较好地弥补CCK-8法的缺点,是较理想的研究奶牛乳腺上皮细胞增殖的方法。

CCK-8与MTT法检测左归丸含药血清干预BMSCs增殖条件的比较

目的探讨CCK-8与MTT法在检测左归丸含药血清干预大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖时所需的最佳实验条件,并比较两种方法的优缺点。方法用左归丸含药血清进行干预P3 BMSCs,孵育结束后,分别加入CCK-8与MTT试剂,检测两种方法的最佳波长、培养时间、灵敏度和增殖时间。结果CCK-8法与MTT法检测BMSCs的最佳波长分别为450 nm和550 nm,孵育时间分别为3 h和4 h,细胞接种密度分别为0.1×10^(4)/孔和0.25×10^(4)/孔。CCK-8法与MTT法在BMSCs接种密度分别高于0.25×10^(4)/孔和0.5×10^(4)/孔时,两种方法检测所得OD值均提早进入平台期,易出现假S型增长曲线。而当密度分别低于0.05×10^(4)/孔和0.1×10^(4)/孔时,细胞增加缓慢,难以形成S型增长曲线,不能反映出BMSCs的增殖特性。与CCK-8法相比较,在细胞密度低于0.1×10^(4)/孔或高于2×10^(4)/孔时,MTT法对BMSCs在翻倍时OD值增加的响应量无明显变化,差异无统计学意义。而细胞密度为0.25×10^(4)/孔至1×10^(4)/孔时,MTT法对BMSCs在翻倍时OD值增加的响应量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论MTT法更适用于左归丸含药血清干预BMSCs增殖和分化的研究。

应用CCK8法检测鸡淋巴细胞活性的检测最佳条件研究

为了研究应用CCK-8法检测鸡淋巴细胞增殖的体外培养最佳条件,试验设置了不同种板细胞数、血清浓度、培养时间、孵育时间和检测波长等条件对其进行比较研究。结果表明:1 750 r/min转速的改良鸡外周血淋巴细胞分离方法效果最佳;在体外增殖培养试验中,CCK-8加样4 h后在450 nm波长处检测OD值最理想,培养时间以44 h为最佳;在细胞数量一致的情况下,胎牛血清浓度为5%或者为10%差异不显著(P>0.05)。当细胞悬液浓度为1×10~6个/m L时,加入100,50,25,12.5μL不同细胞数,4组间比较均差异显著(P<0.05),并且随着细胞悬液浓度的增加OD值增加;最佳铺板细胞的细胞悬液浓度为2.0×10~6~3.0×10~6个/m L,取50~100μL为宜,即最佳细胞铺板数量控制在每孔1.5×10~5~2.0×10~5个/100μL。说明应用CCK-8法检测鸡外周血淋巴细胞活性的最佳条件除种板细胞数不同外,在检测波长、血清浓度、加样后孵化时间等方面与其他动物试验差别不大。

基础医学专业《Cell Counting Kit-8法测定贴壁细胞数》实验课程设计

《细胞生物学研究方法与实验技术》是首都医科大学面向基础医学专业本科生开设的一门理论与实验相结合的课程,《Cell Counting Kit-8法测定贴壁细胞数》是其中的实验课程之一。在本次实验中,针对肝癌细胞系BEL-7402设计不同接种密度、CCK-8孵育浓度和作用时间,通过酶标分析仪检测450 nm处吸光度,然后以细胞密度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制BEL-7402细胞的生长曲线从而明确细胞的增殖情况。笔者在多年的教学实践中通过不断尝试和探索,对本次实验的课程设计,包括实验基本原理、教学目标、实验内容和教学程序等做出归纳和总结,旨在为相关教育工作者的教学实践提供参考。

山东肿足蕨对卵巢癌细胞CAOV-3增殖作用的影响

目的研究山东肿足蕨对卵巢癌细胞CAOV-3增殖作用的影响。方法采用不同浓度山东肿足蕨提取液作用于卵巢癌细胞CAOV-3,采用CCK-8法检测卵巢癌细胞的细胞活力,采用电子显微镜观察细胞形态变化及密度。结果用药24、48 h后,山东肿足蕨对卵巢癌细胞CAOV-3增殖活性呈现抑制作用,48 h抑制效果更显著,经显微镜观察大部分癌细胞形态发生皱缩并变长,部分细胞膜破裂坏死。结论山东肿足蕨提取液能抑制卵巢癌细胞CAOV-3的增殖,经显微镜观察用药后细胞形态受到明显影响,部分细胞破裂严重,增殖速度也受到影响。提示山东肿足蕨提取液对卵巢癌细胞CAOV-3的增殖抑制作用呈现出抗肿瘤活性,为进一步探索山东肿足蕨抗肿瘤提供了研究基础。

弓形虫对4种肿瘤细胞增殖及凋亡的影响

用1×104个/ml^32×104个/ml 6个不同浓度刚地弓形虫RH株速殖子体外分别作用于对数生长期的乳腺癌MCF-7、前列腺癌DU-145、食管癌EC-109和肺癌A549细胞(5×104/ml)24 h,运用CCK-8法测定弓形虫对上述肿瘤细胞的抑制作用,计算细胞抑制率。用1×104、2×104和4×104个/ml弓形虫速殖子体外作用于A549细胞24 h后,流式细胞仪检测肿瘤抑制基因P53和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)基因所编码蛋白质的表达情况。结果显示,随着弓形虫速殖子浓度升高,各肿瘤细胞增殖抑制率增高,其效果与剂量呈正相关。1×104个/ml弓形虫速殖子即对MCF-7、DU-145、EC-109和A549细胞增殖有抑制作用,其抑制率分别为19.7%、4.5%、28.0%和20.8%。各实验组肿瘤细胞增殖情况与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测A549细胞凋亡,凋亡率上升,且p53蛋白表达上调、Bcl-2蛋白表达下调。

CCK-8法与Alamar blue法对RKO细胞株增殖活力测试条件的对比分析

目的以RKO细胞株为增殖活力测试的研究对象，比较CCK-8法与Alamarblue法在检测中波长、孵育时间、细胞密度等方面的差异性。方法取体外培养对数生长期的RKO细胞株，分别比较两者在不同检测波长（380、430、480、530、580、630nm）、不同孵育时间（1、2、3、4、5、6h）、不同细胞密度（2×10^4、5×10^3、1．25×10^3CUF·mL^-1）下所测的光密度值（OD值），并比较两者在相同条件下同-标本重复检测时的平衡性。结果ALamarblue法在不同细胞密度中的最佳检测波长皆为580nm，而CCK-8法的最佳检测波长会随着细胞密度的变化而有所改变；1—6h时，CCK-8法适合的孵育时间在1h以后，Alamarblue为2h以后，且CCK-8法的灵敏度、平衡性都强于Alamarblue法。结论CCK-8法在细胞增殖活力检测中的灵敏性、平衡性、快捷性等都略强于ALamarblue法。

抗菌不锈钢材料的细胞毒性评价研究

目的评价一种新型抗菌不锈钢材料的细胞毒性,并与商品化的两种正畸材料纯钛和普通不锈钢的细胞毒性进行比较。方法用倒置相差显微镜观察L-929细胞在普通不锈钢、抗菌不锈钢和纯钛浸提液中的生长情况,用CCK-8试剂盒检测L-929细胞在不同材料浸提液中培养1、2、3d的吸光度,判断细胞毒性的级别。结果细胞在3种材料的浸提液中均生长旺盛,形态正常。抗菌不锈钢组与普通不锈钢组的吸光度值均低于纯钛组,但2种不锈钢的吸光度值没有统计学差异。细胞毒性分级为1级或0级。结论抗菌不锈钢材料无明显细胞毒性,符合口腔正畸材料的临床应用标准。

人胎盘胎儿侧间充质干细胞无血清培养上清对肺脏上皮细胞氧化应激的保护作用

背景:前期研究证实人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清具有一定的清除活性氧自由基的能力,且本身具有一定的抗氧化酶活性。目的:探究人胎盘胎儿侧间充质干细胞在无血清培养条件下所得上清对氧化应激损伤的肺脏上皮细胞的保护作用及其作用机制。方法:分别使用不同浓度的过氧化氢(200,400,500,600,800μmol/L)对肺脏上皮细胞A549细胞系进行6,12,24 h的氧化刺激,通过CCK-8法对肺脏上皮细胞存活率进行检测,得出存活率为50%时的过氧化氢浓度作为氧化损伤模型的最适条件。用Hochest33258染色及Western Blot对模型有效性进行验证。采用无血清培养基培养胎盘胎儿侧间充质干细胞,收集P3代细胞培养上清将其作用于氧化损伤的肺脏上皮细胞,培养24 h,即上清组。同时设立损伤组(仅进行氧化损伤)和维生素C组(培养基中添加100μmol/L的维生素C)。利用流式细胞术对各组细胞凋亡情况进行检测以及Western Blot检测凋亡相关蛋白及氧化应激经典信号通路Nrf2-Keap1-ARE信号通路相关蛋白的表达。结果与结论:(1)CCK-8法检测得出,采用600μmol/L的过氧化氢对肺脏上皮细胞进行24 h的氧化刺激,A549细胞存活率为(56.41±3.31)%。Hochest33258染色及Western Blot证实模型的可靠性;(2)流式细胞术结果显示维生素C组和上清组氧化损伤细胞的凋亡率与损伤组细胞相比有不同程度的降低,其中上清组与损伤组相比差异有统计学意义(P<0.05);(3)Western Blot对凋亡相关蛋白的检测显示,与损伤组对比,维生素C组和上清组凋亡促进基因Bax蛋白表达减弱,凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表达增强,且差异有统计学意义(P<0.05)。Nrf2-Keap1-ARE信号通路相关蛋白显示与损伤组对比,维生素C组和上清组Nrf2蛋白表达增强,Keap1分子表达减弱且差异有统计学意义(P<0.05);(4)上述结果提示,实验成功构建了肺脏上皮细胞损伤模型,且人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清具有一定的抗氧化能力,能够起到减弱氧化损伤,抑制细胞凋亡的作用,其作用机制可能与激活Nrf2-Keap1-ARE信号通路有关。

4种根管封闭剂体外细胞毒性的比较

目的:评价4种根管封闭剂的生物相容性。方法:本实验通过X射线能谱仪对MTA、AH Plus、Roeko Seal、Cortisomol 4种根管封闭剂进行元素分析,并采用CCK-8法检测各材料凝固后即刻和1周时在100%和50%两种浸提液浓度下对L-929细胞的体外细胞毒性作用。结果:同一固化时间组内两种浸提液浓度相比,AH Plus组无论是固化即刻组还是固化后1周组,当其浸提液浓度为100%时,1、2、4 d各时间点的细胞增殖率均低于50%浸提液(P<0.05),而其他3种封闭剂的即刻组和1周组样本中100%与50%浓度浸提液相比,各时间点的细胞增殖率均无显著性差异(P>0.05)。同一时间点内各封闭剂相比,无论是固化即刻还是固化后1周组,其浸提液浓度无论是100%还是50%,各时间点的细胞增殖率由高至低依次为MTA组、Roeko Seal组、AHplus组、Cortisomol组;MTA组与Roeko Seal组相比P>0.05,其他各组间比较P<0.05。结论:MTA与Roeko Seal的细胞毒性最小,AH Plus的细胞毒性居中,Cortisomol的细胞毒性最大,但毒性级均未超过3级。

内毒素致大鼠肾髓质上皮细胞损伤与水通道蛋白2的表达

目的观察内毒素(LPS)对大鼠肾髓质上皮细胞mIMCD-3的影响及水通道蛋白2(AQP2)表达的变化。方法免疫组化检测AQP2在mIMCD-3的表达及定位。LPS与mIMCD-3培养不同时间后用CCK-8检测吸光度,计算细胞抑制率,检测凋亡和AQP2的表达情况,并做光密度分析。结果免疫组化可见,细胞质中大量棕红色颗粒,证明mIMCD-3表达AQP2。LPS作用于细胞检测细胞抑制率,不同浓度、不同时间组分别做单因素方差分析,具有统计学差异(P<0.05)。将10μg/L的LPS溶液作用于mIMCD-30h,4h,24h和48h后,经流式细胞仪检测结果表明,LPS对mIMCD-3的抑制作用主要表现为细胞凋亡,随作用时间的延长,细胞凋亡增加(P<0.01),作用时间和凋亡率具有直线相关性(R=0.9920)。同时行免疫组化可见,细胞中棕黄色颗粒变稀疏,AQP2表达下调。平均光密度分析具有统计学差异(P<0.01)。结论 mIMCD-3表达AQP2,基础状态下主要定位于细胞浆中。LPS抑制mIMCD-3增殖,具有时间依赖性和剂量依赖性。LPS对细胞增殖的抑制作用主要表现为诱导细胞凋亡。随作用时间延长,细胞凋亡率增加,两者具有直线相关。LPS介导的肾髓质上皮细胞凋亡通路中,AQP2起重要作用。