成骨细胞特异性转录因子OSF2/CBFA1

文章介绍了CBFA基因编码的OSF2/CBFA1转录因子的结构、对成骨细胞生长分化的影响、对骨基质中非胶原蛋白表达水平的调控以及OSF2/CBFA1与遗传性骨病的关系。OSF2/CBFA1作为一种成骨细胞特异性转录因子调控着骨形成过程中成骨细胞的分化,其详细机理有待深入研究。

孕鼠维生素D缺乏对子鼠骨发育相关基因BMP-2、Cbfal、Dmp1表达的影响

目的:研究大鼠孕期维生素D缺乏对其子鼠骨发育相关基因BMP-2、Cbfa1、Dmp1表达的影响。方法:成熟雌性SD大鼠36只随机分为模型组和对照组各18只,模型组以不含维生素D的大鼠饲料避光喂养,对照组以标准饲料正常光照喂养。两周后与成熟SD雄性大鼠交配,分别取孕20天(E20d)、生后1天(B1d)和生后7天(B7d)子鼠左侧股骨。通过Real-TimePCR方法分别比较模型组和对照组胚胎和新生鼠长骨中BMP-2、Cbfa1、Dmp1基因在3个时间点表达的差异。结果:BMP-2mRNA、Cbfa1mRNA及Dmp1mRNA在E20d、B1d和B7d的表达,模型组均明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:BMP-2、Cbfa1、Dmp1均为骨发育相关基因,孕鼠维生素D缺乏可下调子鼠长骨中BMP-2、Cbfa1、Dmp1的表达水平,从而可能影响子鼠骨骼的发育。

肿瘤坏死因子α干预小鼠成骨细胞cbfa1/runx2基因的表达

背景:肿瘤坏死因子α可降低牙周膜纤维细胞碱性磷酸酶的活性,抑制牙周膜纤维细胞向成骨细胞的功能转化。目的:观察肿瘤坏死因子α对小鼠成骨细胞生长及cbfa1/runx2基因表达的影响。方法:取生长良好的小鼠成骨细胞系MC3T3/E1细胞,分别以20,40,60,80μg/L的肿瘤坏死因子α进行干预,以正常培养的细胞作为对照。采用RT-PCR法检测MC3T3/E1细胞cbfa 1/runx2mRNA的表达;PNPP法测定碱性磷酸酶活性;MTT法检测细胞活力。结果与结论:正常培养的MC3T3/E1细胞cbfa1/runx2 mRNA呈阳性表达,随着肿瘤坏死因子α浓度的增高,其表达水平逐渐下降。同时MC3T3/E1细胞活力和碱性磷酸酶活性也随肿瘤坏死因子α浓度的增高而下降。提示肿瘤坏死因子α可抑制MC3T3/E1细胞生长,而cbfa1/runx2可能参与了成骨细胞的分化过程。

Runx2/Cbfa1在出生后小鼠牙髓牙本质复合体形成中的作用研究

目的探讨Runx2/Cbfa1在出生后小鼠成牙本质细胞分化及牙本质形成中时间和空间的分布特点及意义。方法采用免疫组化SABC法检测Runx2/Cbfa1在出生后BALB/c小鼠牙本质、成牙本质细胞及牙髓细胞中不同发育时期的表达及特点。结果Runx2/Cbfa1在成牙本质细胞的发育成熟过程中具有时空特异性,在牙根尚未发育之前的牙胚钟状晚期,Runx2/Cbfa1只在前期牙本质中有表达,在牙髓细胞及成牙本质细胞中皆为阴性;约从第11天开始,随着牙根的发育,Runx2/Cbfa1在根部成牙本质细胞、牙髓细胞中表达为阳性,在冠部成牙本质细胞中表达为阴性。结论Runx2/Cbfa1参与牙本质的形成和矿化及成牙本质细胞和牙髓细胞的发育,可能对它们起重要作用。

转录调控因子CBF1(RBP-Jκ)对Cbfa1和Ose2元件启动子活性的影响

目的探讨Notch信号转录调控因子CBF1(RBP-Jκ)对核心结合因子Cbfa1基因启动子和骨钙素基因启动子区域Ose2元件启动子活性的影响。方法构建CBF1真核表达载体pCMV-Tag4/CBF1;将梯度浓度pCMV-Tag4/CBF1和荧光素酶报告质粒共转染两成骨前体细胞系Kusa-A1和Kusa-O,用双荧光素酶报告基因方法检测Cbfa1和Ose2元件启动子活性。结果随CBF1浓度增加,Kusa-A1和Kusa-O细胞中Cbfa1和Ose2元件启动子活性均逐渐提高。统计分析表明Kusa-A1细胞中1/40μg/μL实验组两启动子活性均与对照组差异显著;Kusa-O细胞中1/40μg/μL实验组Ose2元件启动子活性与对照组差异显著。结论转录调控因子CBF1可以促进Cbfa1和Ose2元件启动子活性,从而可能对细胞的成骨性分化有正调节作用。

cbfa1、satb2双基因共表达载体的构建及鉴定

目的:构建携带cbfa1和satb2双基因的慢病毒真核表达载体。方法:采用PCR技术,从质粒中扩增基因cbfa1和satb2,经TA克隆、酶切筛选后,对阳性重组子进行商业测序鉴定。将测序正确的cbfa1和satb2分别插入pIRES上、下游的相应酶切位点中,构建pIRES-cbfa1-satb2。然后通过双酶切,得到cbfa1-Ires-satb2片段,将其插到含有neo/kana基因的慢病毒载体pLentinTrident1-CMV的相应酶切位点上,构建慢病毒真核表达载体pLentinTrident1-CMV-cbfa1-Ires-satb2。结果:通过PCR技术成功扩增了cbfa1和satb2基因,借助中间载体pIRES中的内部核糖体进入位点,将cbfa1和satb2同时连到了慢病毒载体pLentinTrident1-CMV上,经PCR、酶切及测序验证,质粒构建成功。结论:本实验成功构建了携带cbfa1和satb2双基因的慢病毒真核表达载体,为进一步研究2种基因的功能奠定了基础。

盐酸二甲双胍对成骨细胞增殖、BMP-2及Cbfa-1基因表达的影响

目的初步研究二甲双胍(MF)在体外对小鼠颅盖骨成骨细胞增殖、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)及核心结合因子(Cbfa-1)mRNA表达的影响,探讨二甲双胍对骨代谢的可能作用机制。方法 (1)分离培养原代颅盖骨成骨细胞并对其进行鉴定。(2)以乳鼠成骨细胞为体外实验模型,不同浓度(0、50、100、200、400μmol/L)的MF干预体外培养的成骨细胞24h后,MTT法检测成骨细胞的增殖能力,实时荧光定量PCR法检测成骨细胞BMP-2及Cbfa-1基因表达。结果二甲双胍干预成骨细胞24h后,可促进成骨细胞的增殖,在浓度400μmol/L的OD值最大为0.298±0.047(P<0.05);可促进BMP-2及Cbfa-1mRNA的表达,呈剂量效应关系。结论二甲双胍可促进成骨细胞的增殖和分化,可能通过调节BMP-2及Cbfa-1的表达,从而促进骨的形成。

低氧对H2O2预处理MC3T3-E1增殖和成骨分化功能的影响

背景:活性氧簇增加可以导致氧化应激,体内低氧环境在生理和病理状态下都存在,但处于氧化应激状态的骨组织或者已经有氧化应激损伤的骨系细胞在低氧环境下增殖和分化功能的变化未见相关报道。目的:拟观察小鼠成骨细胞样细胞(MC3T3-E1)在不同浓度H_2O_2干预后处于低氧环境下的成骨细胞生物学特性的改变,以期揭示老年骨质疏松和糖尿病患者骨折愈合过程延长的细胞学机制。方法:用不同浓度H_2O_2干预的小鼠成骨细胞样细胞置于不同的氧浓度下培养,用细胞计数试剂盒(CCK8)检测细胞增殖活性的变化,用碱性磷酸酶染色和钙结节染色检测细胞向成骨方向分化能力的改变,并收集RNA检测成骨分化早期特异性基因信使RNA表达的变化。结果与结论:(1)小鼠成骨细胞样细胞用200μmol/L H_2O_2预处理6 h,细胞的增殖活性随着低氧培养时间延长而增加,但仍然低于正常对照组;成骨分化早期的碱性磷酸酶染色减弱,钙结节形成有明显的减少;(2)用400μmol/L H_2O_2预处理6 h,则细胞的增殖活性下降明显,没有受氧浓度的影响,成骨分化早期的碱性磷酸酶染色减弱,低氧使碱性磷酸酶表达进一步降低,钙结节形成明显减少,但氧浓度改变对其影响不大;(3)400μmol/L H_2O_2预处理6 h和再低氧干预时小鼠成骨细胞样细胞的Cbfa1的信使RNA表达降低,常氧下400μmol/L H_2O_2影响小鼠成骨细胞样细胞的Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶的表达,低氧培养以及氧化应激损伤后的小鼠成骨细胞样细胞成骨分化早期基因Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶的信使RNA表达增加,并且差异有显著性意义;(4)结果证实,低浓度的H_2O_2预处理小鼠成骨细胞样细胞再低氧更容易影响细胞的增殖,而高浓度的H_2O_2预处理小鼠成骨细胞样细胞再低氧更容易影响细胞向成骨方向的分化能力,尤其是早期碱性磷酸酶的形成。

降钙素经ERK-MAPK信号通路调控成骨细胞核心结合因子a1mRNA表达

目的研究降钙素对成骨细胞核心结合因子a1(cbfa1)mRNA表达情况以及细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在这一过程中的作用。方法取24 h内新生SD大鼠颅骨培养成骨细胞,分别加入不同浓度降钙素(0.01、0.1、1 ng/mL)和一定浓度ERK特异性抑制剂U0126进行干预,应用RT-PCR技术检测成骨细胞cbfa1 mRNA的表达情况;应用Western Blot-ting技术检测phos-ERK 1/2蛋白表达情况;采用Independent-Samples检验法分析比较各组间总体均值差异。结果加入0.01、0.1、1 ng/mL的降钙素干预后,成骨细胞表面cbfa1mRNA的表达随降钙素浓度的增加而增强,且中、高浓度组与空白对照组比较差异具有非常显著意义(P<0.01),此外降钙素刺激了phos-ERK1/2蛋白的表达。U0126可阻断以上所有效应。结论降钙素可上调成骨细胞cbfa1mRNA的表达,且ERK-MAPK信号通路参与了此过程。

补肾益髓中药对糖皮质激素性骨质疏松症大鼠骨组织Runx2的mRNA及蛋白表达的影响

目的观察糖皮质激素性骨质疏松症(GIOP)大鼠模型骨组织Runt相关基因2(Runx2)mRNA及蛋白表达,探讨GIOP的发病机制以及补肾益髓中药的疗效及其调控作用。方法采用后肢肌注地塞米松(2.5 mg/kg,每周2次,连续9w)的方法复制GIOP大鼠模型,按体重分层随机分为正常组、模型空白组、补肾益髓中药组、补中益气颗粒组、血府逐瘀胶囊组、骨疏康颗粒阳性对照组。灌胃给药9w。应用XR-26型双能X线骨密度仪测定股骨骨密度,以评价动物模型的成立及药物疗效。实时定量RT-PCR(Real-Time Quantitative RT-PCR)检测骨组织Runx2 mRNA表达,Western blot检测骨组织Runx2蛋白表达。结果 (1)股骨骨密度:与正常组比较,模型空白组明显降低(P<0.01);与模型空白组比较,补肾益髓中药组明显升高(P<0.01),骨疏康颗粒阳性对照组明显升高(P<0.05),补中益气颗粒组和血府逐瘀胶囊组虽有升高趋势,但无统计学意义(P>0.05)。(2)骨组织Runx2 mRNA及蛋白表达:与正常组比较,模型空白组明显降低(P<0.01);与模型空白组比较,补肾益髓中药组明显上调(P<0.01),骨疏康颗粒阳性对照组也有明显上调(P<0.05),补中益气颗粒组和血府逐瘀胶囊组虽有所升高,但无统计学意义(P>0.05)。结论 (1)肌注地塞米松可以成功复制GIOP大鼠模型,(2)骨组织Runx2 mRNA及蛋白表达水平降低可能是GIOP的发病机制之一,(3)应用补肾益髓中药具有明显防治效果,疗效优于健脾中药和活血中药,其作用机理与上调骨组织Runx2 mRNA及蛋白表达密切相关。

Cbfa1/Runt2在牙髓组织和牙髓干细胞中的表达研究

目的:检测Cbfa1/Runt2在成人牙髓组织及牙髓细胞的表达,以便进一步探讨其在成牙本质细胞分化过程中所起的作用。方法:选取因正畸拔除的第一前磨牙牙髓,一部分用于免疫酶标检测,一部分用酶消化法进行细胞培养。取第4代细胞进行Cbfa1/Runt2的免疫荧光检测。选取牙龈组织和牙龈成纤维细胞作为对照。结果:Cbfa1/Runt2在牙髓组织的表达集中在成牙本质细胞下层和血管周围。在牙髓细胞的表达集中在细胞核。结论:Cbfa1/Runt2可能参与成牙本质细胞分化的调控,但其在成牙本质细胞分化过程中所起的作用还需进一步研究。

异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞相关细胞因子表达影响的实验研究

为探讨异补骨脂素加锌对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞相关基因表达的影响,用改良的组织块培养法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞,在成骨细胞体系中加入异补骨脂素与锌,以雌激素为阳性对照,空白组为阴性对照。结果显示:异补骨脂素加锌较单纯应用异补骨脂素或硫酸锌在48 h时促体外大鼠成骨细胞Ⅰ型胶原的表达;异补骨脂素加锌组可以明显上调大鼠成骨细胞TGF-β1的细胞信号转导因子Smad4 mRNA的表达(P<0.01);能促进Runx2/Cbfa1 mRNA的表达(P<0.05)。与空白对照组相比,异补骨脂素组,异补骨脂素加锌组均能增强Osterix mRNA的表达(P<0.05)。与单纯应用异补骨脂素或者锌相比,异补骨脂素与锌联合应用能够协同增效,对促进体外培养的成骨细胞相关转录因子的表达更加明显,探讨了异补骨脂素及其与锌配伍调节骨代谢的分子机制,为提高骨质疏松症的临床疗效以及抗骨质疏松新药的开发提供了实验依据。

口腔组织病理学

人外周血单个核细胞对人牙周膜成纤维细胞增殖和分化的影响，丹参对槟榔碱诱导血管内皮细胞凋亡的保护作用，Runx2／cbfa1在人牙胚发育过程中的表达，SV40在人成牙本质细胞永生化中作用的初步研究，静态牵张应变对人牙周膜成纤维细胞COX-2表达的影响……

颅骨锁骨发育不全家系基因多态性与表型关系的研究

目的研究家族性颅锁骨发育不全家系基因型与临床表型的关系。方法提取临床收集的一个先天性颅锁骨发育不全家系中患者和健康成员外周血基因组DNA,PCR扩增RUNX2/CBFA1基因7个编码外显子及其侧翼内含子序列,分别进行正反向测序,对发现的突变位点行酶切分析验证。结果家系中两位患者(先证者及其父亲)显示cDNA 346T→A的杂合突变,使编码的色氨酸变成精氨酸(W 116R),属错义突变。酶切结果进一步证实了该错义突变。测序还发现先证者父亲cDNA 198G→A的杂合突变,致第66位氨基酸的密码子GCG被GCA取代,但二者均编码丙氨酸,属同义突变。先证者及家系健康成员中未见此改变。结论 RUNX2/CBFA1基因346T→A杂合突变是该家系发病的分子基础。