新疆栽培一枝蒿粗多糖对OVA蛋白的免疫增强作用

目的：探讨新疆栽培一枝蒿粗多糖（ cultivated Artemisia rupestris L. crude polysaccha-rides,CARCP）作为模式抗原卵清白蛋白（ ovalbumin,OVA）佐剂的免疫增强作用。方法将CARCP配伍OVA,皮下免疫小鼠两次,铝佐剂作为阳性对照,ELISA检测IgG及分型IgG1、IgG2a抗体水平；流式细胞术检测脾细胞中T淋巴细胞亚群CD3＋CD4＋和CD3＋CD8＋T细胞,CD4＋CD44＋和CD8＋CD44＋T细胞,以及细胞因子CD4＋IFN-γ, CD8＋IFN-γ和CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg的表达情况。结果 CARCP能提高小鼠IgG、IgG1、IgG2a的抗体水平（P〈0.05）；增强CD3＋CD4＋和CD3＋CD8＋T细胞含量以及CD4＋/CD8＋的比值（P〈0.05）；提高CD4＋CD44＋和CD8＋CD44＋T细胞的含量（P〈0.05）；促进 CD4＋IFN-γ、CD8＋IFN-γ的表达（P〈0.05）,下调 CD4＋CD25＋Treg 中 Foxp3的表达（P〈0.05）。结论CARCP作为OVA蛋白的佐剂能够增强体液和细胞免疫应答,尤其可以增强T细胞免疫应答。

补肾益气平喘方对复合卵蛋白(OVA)哮喘大鼠血清IL-6及肺组织Bax、Bcl-2表达影响与地塞米松等效性随机平行对照研究

[目的]观察补肾益气平喘方对复合卵蛋白(OVA,含佐剂)致敏哮喘大鼠肺组织气道重塑及凋亡因子Bax和Bcl-2表达影响与地塞米松等效性。[方法]使用随机平行对照方法,将清洁级雄性4~5周SD大鼠32只,体质量(180±20g)按随机数字法分为4组,空白对照组、模型组、补肾益气平喘组(中药组)、地塞米松组,8只/组。复合卵蛋白(OVA,含佐剂)致敏大鼠复制哮喘模型,腹腔注射:实验第1d和第7d,各实验组腹腔注射复合卵蛋白致敏剂0.2m L,空白组等量生理盐水;喷雾激发:实验第8d各组大鼠置于超声雾化器下,1%复合卵蛋白致敏剂溶液喷雾激发,空白对照组生理盐水,30min/次·d-1,1次/d,连续14d,至实验第23d结束。灌胃干预:实验第9d,每次雾化激发前药物灌胃,中药组-补肾益气平喘方(1.35g/kg),地塞米松组-地塞米松(0.5mg/kg),连续14d,至实验第23d结束。观测大鼠行为学变化、IL-6(ELISA法),Bax、Bcl-2(Western Blot,WB法)。[结果]实验第23d(造模14d),血清IL-6空白组低于其他各组(P<0.01,P<0.05),模型组高于中药组、地塞米松组(P<0.01),中药组与地塞米松组无显著差异(P>0.05)。肺脏组织Bax模型组低于空白组(P<0.01),中药组、地塞米松组与空白组无显著差异(P>0.05),中药组、地塞米松组高于模型组(P<0.01,P<0.05),中药组与地塞米松组无显著差异(P>0.05)。Bcl2模型组高于空白组(P<0.01),地塞米松组低于空白组(P<0.01),中药组与空白组无显著差异(P>0.05);地塞米松组低于模型组(P>0.05),中药组与模型组、地塞米松组无显著差异(P>0.05)。[结论]补肾益气平喘方灌胃干预复合卵蛋白(OVA)哮喘大鼠,可抑制IL-6表达,升高Bax、Bcl-2表达,与地塞米松具有等效性。

靶向DC-SIGN的Le(x)-OVA抗原的制备

目的制备用于靶向DC-SIGN受体的Le(x)寡糖介导的靶向抗原。方法利用Su lfo-SMCC异源双功能交联试剂交联链霉亲和素(streptavid in,SA)和模式抗原卵白蛋白(ovalbum in,OVA),再利用SA与生物素高亲和力结合的特性,将SA-OVA复合物与生物素修饰的Le(x)寡糖反应,由此获得由Le(x)寡糖介导的靶向抗原Le(x)-OVA复合物。结果应用SDS-PAGE蛋白质电泳和W estern免疫印迹方法证实SA与OVA蛋白成功交联,ELISA方法证实SA-OVA复合物中的SA仍具有与生物素反应的功能,根据SA-OVA复合物与生物素修饰的Le(x)寡糖饱和反应的比例,获得所需要的靶向抗原Le(x)-OVA复合物。结论获得Le(x)寡糖介导的靶向抗原Le(x)-OVA复合物,为进一步研究经由DC-SIGN靶向后的抗原特异性免疫应答奠定了基础。

鼠李糖乳杆菌改善卵清蛋白诱导的食物过敏小鼠症状及其机制

目的考察鼠李糖乳杆菌GG株(LGG)对卵清蛋白诱导的食物过敏小鼠外周血白细胞介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平的影响。方法将食物过敏小鼠分为食物过敏组、LGG低剂量组[1×10~8菌落形成单位(CFU)/mL,每天每只小鼠灌胃200μL]、LGG高剂量组(1×10~9CFU/mL,每天每只小鼠灌胃200μL),以同期10只正常小鼠为对照。造模成功后开始给药,LGG连续灌胃给药22d,过敏模型组和正常小鼠连续灌胃生理盐水22d。检测23d的过敏症状,测定体质量和胸腺指数、脾脏指数,ELISA检测血清卵清蛋白(OVA)特异性IgE、IL-4和IFN-γ水平,HE染色检测小肠组织病变情况和细菌培养法检测粪便菌群的改变。结果各组小鼠的胸腺指数和脾脏指数差异不明显。与对照组比,过敏小鼠模型组IL-4水平、过敏评分、大肠杆菌和类杆菌明显增加,IFN-γ水平降低、IFN-γ/IL-4比值、IgE、体质量、双歧杆菌和乳酸杆菌明显减少;肠道黏膜坏死,部分上皮细胞水肿,坏死。与过敏小鼠模型组比,LGG处理的小鼠IL-4水平、过敏评分、大肠杆菌和类杆菌明显降低,IFN-γ水平升高、IFN-γ/IL-4比值、IgE、体质量、双歧杆菌和乳酸杆菌明显增加,且呈剂量依赖性关系;LGG小鼠肠道黏膜完整,小肠细胞排列紧密。结论LGG可显著改善OVA诱导的食物过敏小鼠的过敏症状,可能与降低外周血IL-4/IFN-γ比值有关。

卵清蛋白致过敏性腹泻小鼠血清和胃组织中5-羟色胺系统的代谢分析

目的探讨卵清蛋白(OVA)致过敏性腹泻小鼠5-羟色胺(5-HT)信号系统的变化。方法 7~8周龄雌性BALB/c小鼠分为模型组、色甘酸钠处理组和对照组。模型组和色甘酸钠处理组分别在0 d和14 d,腹腔注射OVAⅠ(50μg/只)。28 d后,隔天对小鼠进行口服灌胃OVAⅡ(50 mg/只)激发(共8次)。色甘酸钠处理组从28 d开始,隔天(口服灌胃激发前)给予色甘酸钠(78.0 mg/kg)(共8次)。OVA口服灌胃后对小鼠进行综合评分、粪便评分及测定体温变化。43 d后,处死动物。摘眼球取血离心取血清并取胃组织。ELISA检测血清OVA特异性Ig E(OVA-SIg E)。液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)测定血清中的5-HT及其上下游代谢产物犬尿酸(KYN)、色氨酸(TRP)、5-羟色胺酸(5-HTP)和5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)含量,利用实时定量PCR检测过敏小鼠胃组织5-HT代谢相关基因色氨酸羟化酶1(TPH1)、吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)、单胺氧化酶A(MAO-A)、5-HT选择性再摄取转运体(SERT)及其受体5-羟色胺1A受体(HTR1A)、HTR3A、5-羟色胺4受体(HTR4)的mRNA水平。结果 OVA致敏后,小鼠产生严重的过敏性腹泻,血清中的OVA-SIg E明显升高。血清中的KYN显著上升,5-HT、5-HIAA和5-HTP显著下降。胃组织IDO1及其受体HTR1A、HTR3A的mRNA水平增加,TPH1、MAO-A mRNA水平降低。给予色甘酸钠后综合评分、粪便评分、体温及OVA-SIg E明显降低,并且腹泻率也低于模型组,血清中的5-HIAA及胃组织中MAO-A mRNA水平升高,胃组织IDO1、5-HT1A、5-HT3A mRNA水平降低。结论 OVA致过敏性腹泻小鼠5-HT信号系统激活,给予色甘酸钠后,缓解过敏症状并使5-HT代谢相关产物、代谢基因和受体基因的表达发生改变。

鸡卵白蛋白⁃桑葚酒渣花色苷纳米颗粒特性

桑葚酒渣作为桑葚酒酿造过程中的废弃物,富含多酚类生物活性成分,尤其是桑葚花色苷,具有较大的开发利用价值。以桑葚酒渣花色苷为研究对象,考察鸡卵白蛋白(OVA)⁃桑葚酒渣花色苷纳米颗粒的包埋率、外观形态、粒径和电势分布和抗氧化活性,以及在模拟胃肠消化体系中的稳定性。结果表明,当桑葚酒渣花色苷与OVA摩尔比为3∶1时,OVA能包埋最多的桑葚酒渣花色苷。桑葚酒渣花色苷与OVA在磷酸盐缓冲液中能相互作用形成纳米颗粒,其粒径约为40~45 nm。OVA⁃桑葚酒渣花色苷纳米颗粒较未包埋桑葚酒渣花色苷清除1,1⁃二苯基⁃2⁃三硝基苯肼(DPPH)自由基和2,2′⁃连氮基⁃双⁃(3⁃乙基苯并二氢噻唑啉⁃6⁃磺酸)二铵盐(ABTS)自由基能力明显增强。在模拟胃消化模型中,包埋前后的桑葚酒渣花色苷稳定性没有显著性差异;在模拟肠消化模型中,包埋后的桑葚酒渣花色苷稳定性显著提高,未包埋的花色苷在4.0 h后含量降低83.00%左右,而有OVA包埋的桑葚酒渣花色苷含量只降低45.00%左右,表明OVA与桑葚酒渣花色苷结合对花色苷的抗氧化稳定性有较好的保护作用。研究结果为桑葚酒渣花色苷的开发利用提供理论依据。

新的肿瘤相关抗原(OVA66)的研制和临床初步应用

目的 制备OVA6 6蛋白和其抗体,探讨其检测肿瘤的应用价值。方法 应用原核表达技术和Ni2 + 亲和层析法,制备纯化的OVA6 6蛋白,经SDS- PAGE电泳鉴定,将纯化蛋白加佐剂免疫家兔,获得抗OVA6 6蛋白抗血清,并应用WesternBlot测定其滴度和特异性。利用OVA6 6蛋白和其抗体分别建立ELISA和免疫组化法,测定正常人和肿瘤患者的血清OVA6 6抗体水平和肿瘤组织标本中OVA6 6蛋白表达量。结果 获得的高纯度OVA6 6蛋白和高滴度、特异性抗OVA6 6抗血清。ELISA检测显示,正常人和肿瘤患者血清抗体水平存在显著性差异(P <0 .0 0 1)。正常人组OD均值为0 . 2 0±0 0 5 ,肿瘤患者组OD均值为0 . 36±0. 12 ,肿瘤患者中阳性率为4 0 % (46 / 116 )。免疫组化法结果表明,肿瘤组织标本阳性率达81% (34/ 4 2 ) ,而正常组织均为阴性。结论 应用OVA6 6蛋白和其抗血清建立的检测方法,为临床肿瘤辅助诊断的应用奠定基础。

化痰活血方对哮喘小鼠IL-17A和IL-13的影响

目的研究化痰活血方(川芎、当归、白芍等)对哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素IL-17A、IL-13和肺组织血管内皮生长因子-2(VEGFR2)表达的影响。方法小鼠用卵清蛋白(OVA)腹腔注射致敏,并予2%OVA雾化吸入激发的方式建立哮喘小鼠模型,HE染色观察肺组织病理炎症,PAS染色观察肺组织杯状细胞增生情况,酶联免疫法(ELISA)测定BALF中细胞因子IL-17A和IL-13的量,免疫印迹法(Western blot)测定蛋白VEGFR2在肺组织中的表达。结果哮喘组肺部的炎症评分、杯状细胞增生、BALF中IL-17A和IL-13与蛋白VEGFR2的量均明显高于正常组(P<0.05,P<0.01)。与哮喘组比较,化痰活血方组小鼠肺组织病理炎症和杯状细胞增生均减轻,BALF中IL-17A和IL-13的量降低(P<0.05,P<0.01),而肺组织中蛋白VEGFR2的表达无明显变化(P>0.05)。结论化痰活血方可能通过调节IL-17A和IL-13途径来缓解哮喘小鼠症状。

穴位敷贴对过敏性鼻炎小鼠腹腔肥大细胞脱颗粒影响的实验研究

目的研究不同处理卵白蛋白(OVA)过敏性鼻炎小鼠模型腹腔肥大细胞脱颗粒的影响。方法分离不同处理组别小鼠腹腔肥大细胞,中性红染色后计算腹腔肥大细胞脱颗粒率。结果正常空白对照组、OVA过敏性鼻炎组、穴位敷贴治疗组、激素阳性对照组、PBS阴性对照组小鼠腹腔肥大细胞脱颗粒率分别为(15±6)%、(53±11)%、(37±13)%、(31±15)%、(47±14)%。结论OVA过敏性鼻炎小鼠的腹腔肥大细胞有明显的脱颗粒现象;与OVA过敏性鼻炎小鼠相比,穴位敷贴治疗组及激素阳性对照组小鼠的腹腔肥大细胞脱颗粒现象显著减轻;PBS阴性对照组小鼠的腹腔肥大细胞脱颗粒现象没有明显变化。推测穴位敷贴抗过敏机制为稳定肥大细胞膜,抑制肥大细胞脱颗粒,减少致炎介质产生。

小鼠特应性皮炎建模方法的改进

目的用卵清蛋白(OVA)致敏小鼠特应性皮炎(atopic dermatitis,AD),建立一种更为简便、稳定的小鼠AD模型。方法采用6周龄BALB/c雌性小鼠,第1日腹腔注射200μg/m L OVA溶液0.5 m L系统致敏,第6日皮下注射100μg/m L OVA溶液0.5 m L再次致敏。并于第18、39日背部局部贴含50μL,1 000μg/m LOVA的1.5 cm2的无菌纱布,每日更换,分2次局部致敏,各持续1周。第46日,观察小鼠皮肤及其病理学改变,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中总Ig E水平,统计成模率及动物死亡情况。结果 AD模型小鼠皮肤肉眼可见潮红、脱屑、偶见结痂等皮炎改变;病理可见表皮细胞增厚,过度角化,真皮内淋巴细胞等浸润。模型组小鼠血清总Ig E水平为(6 296.17±1 021.28)ng/L,显著高于空白对照组的(1 280.97±501.24)ng/L和生理盐水组的(1 327.57±629.71)ng/L(均P<0.01)。成模率为94%,死亡率6%。结论该方法可以成功建立小鼠AD模型,造模方法简单,成模率高。

两个豚鼠品系速发型哮喘模型中组胺受体的表达及对肺功能的影响

目的建立Zmu-I：DHP和DHP两个豚鼠品系的速发型哮喘模型，探讨组胺受体I（HIR）和组胺受体2（H2R）在肺组织中的表达及对肺功能的影响。方法两个豚鼠品系分别设置模型组（MW，MP）和对照组（BW，BP），模型组采用卵清白蛋白（OVA）致敏，对照组使用生理盐水。第1，14日致敏豚鼠，第28日用OVA雾化激发，记录0～8min内动态肺顺应性（Cdyn）和气道阻力（Raw）变化。取肺组织样品，进行H1R和H2RmRNA表达检测和免疫组织化学分析。结果OVA雾化激发后，Zmu－1：DHP和DHP品系模型组（MW，MP）Cdyn下降，Raw上升，变化幅度先大后小，约3min达到最大，而两品系对照组（BW，BP）变化较小。其中，MW组反应较MP组更敏感。定量PCR分析，MW模型组的H1R，H2RmRNA表达量高于对照组BW（P〈0．05，P〈0．05），肺组织切片HE染色，模型组（MW，MP）肺泡间可见明显的炎症细胞浸润，而对照组（Bw，BP）未见。免疫组织化学可见，HIR和H2R主要分布在气道和血管周围的平滑肌上。结论速发型哮喘模型，HIR和H2R主要分布在肺部气管周围的平滑肌上，H1R的高表达与哮喘模型的气道敏感性密切相关。

靶向DEK适配体DTA-64可通过阻断TGF-β1信号通路抑制支气管哮喘小鼠气道上皮细胞的上皮间质转化

目的 本研究旨在探讨靶向DEK适配体64(DTA-64)对卵清蛋白(OVA)诱导的哮喘小鼠气道炎症和EMT的抑制作用。方法 选取雌性BALB/c小鼠32只(8周龄),随机分为PBS组、 OVA模型组、 DTA-64组(1μg/只)和对照适配体组,每组8只。肺组织HE染色检测气道周围炎性细胞浸润,免疫组织化学染色检测气道周围DEK表达;ELISA检测血清IgE以及支气管肺泡灌洗液(BALF)的2型辅助T(Th2)细胞因子白细胞介素4(IL-4)、 IL-5、 IL-13以及Th1细胞因子γ干扰素(IFN-γ)水平。Western blot法检测上皮间质转化(EMT)相关蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、兔抗锌指转录因子(Snail+Slug)、波形蛋白(vimentin)和上皮钙黏素(E-cadherin)相关蛋白以及转化生长因子β1/Smad(TGF-β1/Smad)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的蛋白表达;流式细胞术检测肺单细胞悬液中α-SMA,探讨DTA-64对哮喘EMT和气道重塑中的作用机制。结果 DEK蛋白在哮喘模型小鼠肺组织高表达,在DTA-64组中低表达;DTA-64能够降低气道周围嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的浸润,下调血清OVA特异性IgE和BALF中IL-4、 IL-5、 IL-13水平,上调IFN-γ水平;DTA-64还能降低肺组织vimentin、α-SMA、 Snail+Slug表达,上调上皮标志物E-cadherin表达;DTA-64能抑制TGF-β1及其下游经典通路Smad2/3、 Smad4表达,以及非经典通路ERK1/2、 p38 MAPK、 JNK和PI3K/AKT/mTOR的磷酸化水平。结论 DTA-64可能通过阻断TGF-β1/Smad、 MAPK、 PI3K信号通路抑制OVA诱导的哮喘小鼠气道炎症和EMT的进程,从而抑制哮喘气道重塑。

阿维链霉菌来源EndoH在枯草芽孢杆菌中的表达及应用

内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶H(Endo H)是一类识别并切割与糖肽和糖蛋白的天冬氨酸残基连接的寡聚糖上N-乙酰氨基壳糖核心的糖苷酶,可用于糖组学中大规模糖基化位点的鉴定。克隆阿维链霉菌来源的endo H,成功构建p MA0911.1-Endo H重组质粒,并转化到枯草芽孢杆菌WB600中。发酵液经疏水层析和离子交换层析等技术手段得到目的蛋白Endo H。通过重组Endo H高效率酶切RNase B及对鸡卵清标准糖蛋白(OVA)的N-糖链结构的鉴定,表明重组Endo H在糖组学N-糖链结构研究中具有良好的应用前景。

IL-17作为分子佐剂增强蛋白疫苗细胞免疫应答的研究

目的:为了进一步增强重组蛋白质疫苗的细胞免疫应答,利用重组的IL-17作为分子佐剂,与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)一起免疫小鼠,研究IL-17作为分子佐剂对适应性免疫的影响,探索IL-17对蛋白疫苗诱导的免疫反应,特别是细胞免疫应答的影响。方法:用OVA作为特异性蛋白疫苗,与不同剂量的IL-17联合免疫C57BL/6小鼠;分别在第0,2周进行免疫,在第3,4周分别检测抗-OVA IgG水平,T淋巴细胞增殖能力,细胞因子表达水平和体内细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)杀伤作用等免疫学指标。结果:以OVA作为的蛋白疫苗在IL-17作为佐剂情况下能够增强抗原特异性的免疫反应,尤其是有效提高细胞免疫应答水平。与单注射OVA蛋白组相比,不同剂量的IL-17不仅增强了OVA特异性抗体水平,而且均能够增强CD 4+T和CD 8+T细胞分泌IL-17的能力,尤其对CD 8+T细胞分泌IFN-γ的表达水平和体内CTL的效果增加明显。结论:IL-17作为蛋白质疫苗的分子佐剂能够增强抗体水平,特异性CD8+T细胞活性,尤其是增强体内特异性的CTL反应,这为增强蛋白质疫苗的特异性细胞免疫反应提供了一个新方法。

巴卡丁Ⅲ对模式抗原鸡卵清白蛋白的免疫佐剂作用

研究巴卡丁Ⅲ对模式抗原鸡卵清白蛋白（OVA）在小鼠上引起的免疫效果.小鼠分6组（n=8）,对照组为生理盐水组,试验Ⅱ组为OVA组,试验Ⅲ～Ⅴ组在试验Ⅱ组上分别再添加50、100、200μg的巴卡丁Ⅲ,试验Ⅵ组在试验Ⅱ组上再添加200 μg铝胶,每次免疫间隔3周,共免疫2次.免疫后2周后分离小鼠血清和脾淋巴细胞,分析样品中IgG、IgG亚类、IgM水平,淋巴细胞增殖反应以及细胞因子表达情况.结果表明：OVA中添加巴卡丁Ⅲ可以显著提高机体产生更强的IgG,IgG亚类和IgM反应（P＜0.05）;添加巴卡丁Ⅲ试验组显著增强了脾淋巴细胞体外对OVA的刺激增殖指数、细胞因子（IL-4,IL-10,IFN-γ和IL-12）的表达（P＜0.05）.巴卡丁Ⅲ具有很好的佐剂效果,是一个理想的疫苗候选佐剂.

吸入水雾剂的过敏性试验方法研究

目的:建立与吸入水雾剂临床给药方式相似,可用于评价吸入水雾剂过敏性的实验方法。方法:Hartley豚鼠24只,雌雄各半,随机分为阴性对照组及3个给药组。给药组于1、3、5 d按每只2 mL吸入浓度为1%的雾化卵白蛋白(ovalbumin,OVA)致敏,阴性对照组以氯化钠注射液(NS)同法处理。于首次致敏后14 d将给药组分别以0.5%、1%或2%OVA激发,阴性对照组以NS代替OVA同法处理。激发后观察豚鼠出现的过敏症状,取血检测血液中嗜酸性粒细胞(eosnophils,EOS)比例。取肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)检测组胺(histamine,HIS)水平。解剖豚鼠,大体观察后取鼻粘膜、气管和肺进行病理学检查。结果:给药组豚鼠出现不同程度过敏症状及相应病理学改变,过敏反应严重程度、EOS比例及HIS水平均与激发液OVA浓度相关。结论:豚鼠吸入致敏与激发的过敏性实验方法能反映典型过敏症状,方法稳定、简易,能较好地应用于吸入水雾剂的过敏性评价。