Survivin shRNA增强人卵巢癌耐药细胞OVCAR3对泰素敏感性的研究

背景与目的:耐药是目前恶性肿瘤治疗急需解决的难题。最近研究显示,卵巢癌组织及细胞中均有Survivin高表达,可能与其抑癌耐药有关。本研究探讨Survivin的短发夹状RNA(shorthairpinRNA,shRNA)对人卵巢癌耐药细胞OVCAR3Survivin基因表达、凋亡及其对泰素、顺铂敏感性的影响。方法:脂质体介导SurvivinshRNA转染OVCAR3。转染空载体或脂质体的细胞及未转染细胞作为对照。逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)检测SurvivinmRNA的表达,流式细胞仪分析Survivin蛋白的表达及细胞凋亡率。四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)测定SurvivinshRNA转染后OVCAR3细胞对泰素的敏感性。结果:与未转染组、空脂质体组、空载体组相比较,SurvivinshRNA处理24h后细胞SurvivinmRNA及蛋白表达水平均明显下调。SurvivinshRNA转染12、24、36、48h后的细胞凋亡率分别为20.7%、31.9%、39.0%、46.7%,呈时间依赖性。MTT结果显示,泰素对未转染组、空脂质体组、空载体组、转染组OVCAR3细胞的IC50分别为(0.305±0.032)μmol/L、(0.157±0.031)μmol/L、(0.175±0.010)μmol/L、(0.019±0.001)μmol/L;顺铂对4组OVCAR3细胞的IC50依次为(9.410±0.796)μmol/L、(6.675±1.739)μmol/L、(6.930±1.273)μmol/L、(7.862±0.081)μmol/L,SurvivinshRNA使OVCAR3对泰素的敏感性提高16倍(P<0.01),但是对顺铂的影响不大(P>0.05)。结论:靶向Survivin的序列特异性shRNA可有效抑制OVCAR3细胞中Survivin基因的表达,同时可以增强OVCAR3对泰素的敏感性,但不增加其对顺铂的敏感性。

顺铂处理卵巢癌细胞系OVCAR3引起Survivin表达差异的研究

的 探讨顺铂(DDP)处理卵巢癌细胞系时Sur-vivin表达是否有变化,进而探讨Survivin表达与肿瘤细胞耐药之间的关系及其在肿瘤细胞获得性耐药及细胞凋亡耐受所起的重要作用。方法 以卵巢癌细胞系OVCAR3为材料,用MTT比色法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡。RT-PCR检测Survivin mRNA表达差异,Western blot检测Survivin蛋白表达变化。结果 顺铂抑制卵巢癌细胞生长,具有时间和浓度依赖效应,即随时间延长和浓度增加,细胞生长抑制越强,细胞凋亡率也有同样的趋势,最高达31.6％。1mg·L^(-1)DDP处理卵巢癌细胞,Survivin mRNA及蛋白表达随作用时间的增长,分别在8 h和12 h达最高,随后又降低。结论 抗凋亡蛋白Survivin在卵巢癌细胞系中呈高表达,顺铂处理卵巢癌细胞,Survivin mRNA表达随作用时间延长而增加,这可能是卵巢癌细胞对化疗药物产生耐药性的重要因素之一。

GnRH激动剂曲普瑞林对卵巢癌细胞OVCAR3生长的抑制作用及对GnRHⅠ受体、GnRHⅡ受体表达的影响

目的观察促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂曲普瑞林对卵巢癌细胞生长的抑制作用并探讨其对GnRHⅠ受体、GnRHⅡ受体表达的影响。方法选用不同浓度曲普瑞林刺激卵巢癌细胞OVCAR3后,采用MTT方法检测其对细胞的增殖活性的影响,并运用RT-PCR方法,检测曲普瑞林对卵巢癌细胞OVCAR3 GnRHⅠ受体、GnRHⅡ受体表达的影响。结果 10-7mol/L浓度的曲普瑞林作用细胞24 h后,其增殖抑制率为(41.07±0.43)%,随着浓度的增加(10-6 mol/L,10-5 mol/L,10-4 mol/L,10-3 mol/L,10-2 mol/L),抑制率逐渐增加,分别为(50.56±0.76)%、(69.86±1.05)%、(65.43±0.87)%、(62.09±1.24)%、(58.69±0.87)%;以10-5 mol/L浓度的曲普瑞林抑制率最高,有统计学意义(P<0.05);以10-5mol/L浓度的曲普瑞林作用于细胞24 h、48 h、72 h后,增殖抑制率分别是(69.86±1.08)%、(58.69±0.98)%、(48.56±1.02)%,最终是作用时间在24 h时抑制率最高,有统计学意义(P<0.05)。GnRHⅠ受体、GnRHⅡ受体的表达:在曲普瑞林10-5mol/L浓度作用于细胞24 h后最高。结论曲普瑞林对卵巢癌细胞OVCAR3生长有抑制作用,GnRHⅠ受体、GnRHⅡ受体表达变化与GnRH激动剂的作用机制有关。

HDAC2 siRNA转染对卵巢癌ovcar3细胞中p53和乙酰化p53k320表达的影响

目的:探讨靶向沉默组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)对人卵巢癌ovcar3细胞中p53乙酰化位点k320表达的影响。方法:将ovcar3细胞随机分为空白组、对照组和实验组3组,实验组以HDAC2 siRNA转染细胞,对照组转染对照siRNA,空白组不处理,分别采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测3组细胞中HDAC2 mRNA和蛋白的表达,Western blot检测3组细胞中p53、乙酰化p53k320蛋白的表达。结果:与空白组及对照组相比,实验组HDAC2 mRNA和蛋白的表达降低(P<0.05),p53蛋白和乙酰化p53k320蛋白表达均升高(P<0.05)。结论:下调HDAC2的表达可使p53和乙酰化p53k320表达增加。

自噬在拓扑替康诱导卵巢癌细胞OVCAR3死亡中的作用

目的研究自噬在拓扑替康诱导卵巢癌OVCAR3细胞死亡中的作用。方法采用不同浓度的拓扑替康处理卵巢癌OVCAR3细胞,MTT法测定拓扑替康对OVCAR3细胞增殖的抑制作用,单丹磺酰尸胺(MDC)荧光染色观察给药后OVCAR3细胞的自噬征象,LDH漏出率法检测拓扑替康联合自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对拓扑替康诱导OVCAR3细胞毒性的影响,MTT法测定拓扑替康联合自噬诱导剂雷帕霉素对OVCAR3细胞增殖抑制的影响,金氏公式分析联合作用效果。结果拓扑替康对OVCAR3细胞的生长有显著的抑制作用,呈明显的剂量依赖性,半数抑制浓度(IC50)为0.057μg/ml。MDC荧光染色显示拓扑替康可诱导OVCAR3细胞产生自噬囊泡,3-MA可以抑制拓扑替康诱导的自噬产生,雷帕霉素可以增强拓扑替康诱导的细胞自噬。细胞培养24h后,拓扑替康组LDH漏出率为22.5%,3-MA+拓扑替康组为16.8%;48h后拓扑替康组LDH漏出率为47.4%,3-MA+拓扑替康组为32.6%。雷帕霉素联合各浓度拓扑替康用药组的抑制率较拓扑替康单药组增加,按金氏公式计算,除最高浓度组(拓扑替康0.2μg/ml)外,其他各组q值均>1.15。结论拓扑替康对OVCAR3细胞有显著抑制作用并能够诱导其发生自噬,诱导自噬性细胞死亡可以提高拓扑替康对OVCAR3细胞的抗肿瘤作用。

红毛五加提取物诱导卵巢癌细胞系OVCAR3凋亡

目的研究红毛五加提取物的抗肿瘤活性。方法分别采用MTT法、形态学、流式细胞术方法检测纯氯仿洗脱部分对肿瘤细胞OVCAR3的生长抑制及促凋亡。结果 MTT法可见氯仿洗脱部分对体外培养的卵巢上皮癌细胞OVCAR3的生长有抑制作用,高、低剂量组抑制率分别为20.6%、11.4%;形态学以及流式细胞术都可见氯仿洗脱部分可以促进OVCAR3凋亡。结论红毛五加纯氯仿洗脱部分对肿瘤细胞株OVCAR3细胞有促凋亡的作用。

促性腺激素释放激素对人卵巢癌细胞系OVCAR3体外生长调控作用的研究

目的观察GnRH受体在人卵巢癌细胞系OVCAR3中的表达,并研究促性腺激素释放激素激动剂(Triptorelin)对卵巢癌细胞体外生长调控作用。方法采用免疫组化SP法检测卵巢癌细胞系OVCAR3 GnRH I受体的表达;分别应用不同浓度Triptorelin作用于细胞,MTT法检测细胞生长抑制率。结果人卵巢癌细胞系OVCAR3表达GnRH I受体,Triptorelin可明显抑制GnRH I受体阳性的OVCAR3细胞生长。结论促性腺激素释放激素激动剂Triptorelin通过与人卵巢癌OVCAR3细胞株GnRH I受体结合,发挥抗增殖的作用。

锌指蛋白A20表达沉默促进OVCAR3卵巢癌细胞凋亡的实验研究

肿瘤坏死因子（TNF）-α具有选择性杀伤肿瘤细胞的特性,是肿瘤治疗的基本途径之一。锌指蛋白A20是一种最早发现于人脐静脉内皮细胞的TNF诱导性基因产物,是一种立即早期反应基因。在包括脂多糖（LPS）、TNF-α、白细胞介素（IL）-1或CD40-CD40L结合在内的多种刺激下，锌指蛋白A20表达于包括肿瘤细胞在内的各类细胞。

PELP1对人卵巢癌OVCAR3细胞株侵袭能力及MMP-2、MMP-9表达的影响

目的观察脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1(PELP1)对人卵巢癌OVCAR3细胞株侵袭能力及MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达的影响。方法体外培养OVCAR3细胞,分为对照组与实验组。对照组转染Flag空载,实验组转染Flag-PELP1。转染24 h后检测转染情况;采用real-time PCR法检测OVCAR3细胞中的MMP-2、MMP-9mRNA,Western blotting法检测其蛋白;Transwell小室侵袭实验检测OVCAR3细胞侵袭能力。结果 OVCAR3细胞中瞬时转染Flag-PELP1,PELP1蛋白表达明显增加。实验组MMP-2、MMP-9 mRNA表达量分别为2.804 8、2.466 6,对照组分别为1、1;实验组MMP-2、MMP-9蛋白表达量分别为0.599 2、0.654 6,对照组分别为0.260 7、0.121 6;实验组与对照组MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表达量相比,P均<0.05。实验组与对照组自Transwell小室上层移至下层的细胞数分别为774、1 203,两组相比,P<0.05。结论 PELP1可增强人卵巢癌OVCAR3细胞株的侵袭能力,并上调MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表达。

卵巢癌细胞系OVCAR3过表达SND1稳定株的构建

目的:通过慢病毒载体构建过表达SND1的OVCAR3稳定的表达株。方法:重组的pLVX-FLAG-SND1表达载体与包装质粒共同转染293T细胞,获得携带FLAG-SND1的重组慢病毒。病毒感染的OVCAR3细胞经Hygromycin B筛选出稳定表达株。用Western blot方法检测SND1蛋白表达。结果:用病毒感染OVCAR3细胞,药物筛选后获得的过表达稳定株中SND1蛋白表达水平明显增高。结论:利用慢病毒表达载体pLVX-FLAG-SND1成功感染并筛选出稳定表达SND1的OVCAR3细胞株,为进一步研究SND1在卵巢癌中的作用提供了体外细胞系模型。

临床常用中药制剂对OVCAR3细胞的药效学比较

目的比较临床常用中药制剂对OVCAR3细胞OVCAR3的药效学。方法以采用实时无标记细胞分析(RTCA)检测榄香烯注射液、参芪扶正注射液、艾迪注射液、复方苦参注射液、消癌平注射液、康艾注射液、康莱特注射液对OVCAR3细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用,JC-1检测上述药物对肿瘤细胞线粒体膜电位的影响,CCK8法检测它们对正常细胞系MRC-5的毒性作用。结果榄香烯注射液、消癌平注射液、复方苦参注射液、艾迪注射液抑制OVCAR3细胞增殖的IC_(50)值分别为(44.98±0.13)μg/mL、(258.78±6.53)mg/mL、(121.73±1.23)mg/mL、(51.73±0.51)mg/mL,中、高剂量榄香烯注射液有明显抑制OVCAR3细胞迁移的作用;除康莱特注射液外,其他药物都有一定程度抑制OVCAR3细胞侵袭的作用。榄香烯注射液、消癌平注射液在IC_(50)剂量下作用24 h后,可检测到线粒体膜电位的改变。榄香烯注射液、艾迪注射液IC_(50(MRC⁃5))/IC_(50(OVCAR3))均大于1。结论以OVCAR3细胞为对象时,榄香烯注射液抗肿瘤作用最好,其次是艾迪注射液。

GnRH激动剂Triptorelin对人卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3生长抑制作用的研究

目的观察GnRH受体在人卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3中的表达,并研究GnRH激动剂(Triptorelin)对卵巢癌细胞生长的抑制作用。方法采用免疫组化SP法检测两种细胞系内GnRH受体的表达,分别应用不同浓度Triptorelin作用于细胞,MTT法检测细胞生长抑制率。结果人卵巢癌细胞系OVCAR3表达GnRHⅠ受体,SKOV3细胞系不表达GnRHⅠ受体,Trip-torelin可明显抑制GnRHⅠ受体阳性的OVCAR3细胞生长,对GnRHⅠ受体阴性的SKOV3细胞生长无明显抑制作用。结论GnRH激动剂Triptorelin通过与人卵巢癌细胞株GnRHⅠ受体结合,发挥抗增殖的作用。

FOXA2过表达对卵巢癌OVCAR3细胞上皮-间充质转化的抑制作用及机制研究

目的检测叉头框架蛋白A2(FOXA2)在卵巢癌细胞中的表达情况,探讨其对上皮间质转化(EMT)的抑制作用及机制。方法培养卵巢癌上皮细胞系OVCAR3,构建并转染FOXA2过表达载体。采用CCK-8法、Transwell实验分别检测FOXA2过表达对OVCAR3细胞增殖、侵袭能力的影响;采用Western blot法及免疫荧光实验检测FOXA2过表达后OVCAR3细胞EMT发生相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)以及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin的改变。结果FOXA2过表达明显抑制了OVCAR3细胞的增殖、侵袭能力。OVCAR3细胞FOXA2过表达后显著上调了E-cadherin蛋白的表达,下调了Vimentin蛋白的表达,即EMT过程受到了抑制。免疫荧光结果显示FOXA2过表达后OVCAR3细胞中β-catenin蛋白在细胞质和细胞核中出现明显的异位聚集。结论FOXA2过表达可能通过Wnt/β-catenin信号通路影响了EMT过程,进而抑制了卵巢癌OVCAR3细胞的增殖和侵袭能力。

NS398对人卵巢癌细胞系CAOV3和OVCAR3生长抑制作用的研究

目的 观察环氧合酶 2 (cyclooxygenase 2 ,COX 2 )选择性抑制剂———氮 2 ,环己氧 4 ,硝基苯 甲基磺胺 (NS398) ,对人卵巢癌细胞系CAOV3和OVCAR3生长的抑制作用。方法 应用免疫组织化学 (免疫组化 )链霉菌抗生物素蛋白 过氧化物酶连接 (SP)法 ,在蛋白水平 ,对人卵巢上皮浆液性癌细胞系CAOV3、OVCAR3的COX 2表达情况进行检测 ;采用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)快速比色法 ,观察NS398对CAOV3、OVCAR3生长的抑制作用 ,并通过倒置相差显微镜及电子显微镜观察细胞形态学的变化 ;通过DNA梯形电泳和末端脱氧核苷转移酶 (TdT)介导的脱氧尿嘧啶三磷酸(dUTP)缺口末端标记 (TUNEL)实验 ,对细胞凋亡情况进行检测。结果 CAOV3、OVCAR3的COX 2蛋白表达均为阳性。NS398对CAOV3、OVCAR3增殖的抑制率 ,均随着作用时间的延长和药物浓度的增加而增加。NS398作用后 ,CAOV3、OVCAR3细胞胞浆空泡化 ,可见凋亡小体 ,细胞表面的微绒毛消失。DNA梯形电泳显示特征性的梯形谱带 ,TUNEL实验可见凋亡细胞。结论 COX 2很可能成为卵巢癌化学药物治疗 (化疗 )的有效靶点 ,COX

超声破坏促黄体生成激素释放激素靶向微泡联合紫杉醇对卵巢癌OVCAR3细胞株的影响

目的探讨超声破坏卵巢癌靶向超声造影剂(ovarian cancer targeted ultrasound contrast agent,OCTUCA)即黏附促黄体生成激素释放激素(luteinizing hormone releasing hormone,LHRH)的脂质体微泡(LM)联合紫杉醇对人卵巢癌OVCAR3细胞株增殖、凋亡及细胞内药物浓度的影响。方法在体外培养OVCAR3细胞株,经MTT比色法检测紫杉醇对OVCAR3体外治疗的有效浓度,然后分别用OCTUCA、紫杉醇、紫杉醇联合超声、超声破坏脂质体微泡联合紫杉醇及超声破坏OCTUCA联合紫杉醇进行处理,MTT检测细胞增殖抑制率、流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡率、高效液相色谱(HPLC)法检测细胞内紫杉醇浓度。结果紫杉醇对OVCAR3体外治疗的有效浓度是10-6mol/L,超声破坏OCTUCA联合紫杉醇组细胞增殖抑制率及凋亡率均明显高于OCTUCA、紫杉醇、紫杉醇联合超声、超声破坏脂质体微泡联合紫杉处理组(P均<0.05),超声破坏OTUCA联合紫杉醇组细胞内药物浓度明显高于紫杉醇、紫杉醇联合超声、超声破坏脂质体微泡联合紫杉醇处理组(P<0.01)。结论超声破坏OCTUCA联合紫杉醇能使OVCAR3细胞内紫杉醇药物浓度增加,抑制其增殖,并诱导其凋亡。

卵巢癌OVCAR3细胞中CD133^＋细胞群的分离及其特性

卵巢癌的病死率居妇科恶性肿瘤之首，5年生存率不足30％，其发生、发展机制尚不清楚。肿瘤干细胞理论认为，肿瘤中存在一小群具有自我更新和多向分化潜能的细胞，即肿瘤干细胞，可能是肿瘤转移和复发的根源。

FANCF-shRNA质粒构建及其对卵巢癌细胞OVCAR3沉默效应的观察

目的:构建针对人FANCF基因的特异性shRNA真核表达载体,体外观察siRNA对卵巢癌OVCAR3细胞系FANCF基因的沉默效应。方法:采用基因克隆技术,将设计合成的能表达短发夹RNA的寡核苷酸序列插入真核表达质粒载体pSilencerTM4.1-CMV-neo,构建能表达FANCF-shRNA的真核表达载体;转染人卵巢癌OVCAR3细胞,提取总RNA和蛋白,RT-PCR验证mRNA表达的变化,蛋白质印迹法验证蛋白表达的变化。结果:质粒酶切和测序证实成功构建了FANCF-shRNA的真核表达载体。与野生型OVCAR3相比,脂质体法转染卵巢癌OVCAR3细胞后,FANCFmRNA 24、48和72 h的表达水平与阴性控制组比较均下调,抑制率分别为(23.91±6.58)%(、51.23±5.86)%和(47.42±7.52)%;FANCF蛋白在244、8和72 h的表达水平与阴性控制组比较亦下调,抑制率分别为(16.28±5.46)%(、24.42±6.85)%和(36.05±8.26)%。证实FANCF-shRNA具有沉默OVCAR3细胞FANCF基因表达的效应。结论:siRNA-FANCF干扰可引起卵巢癌OVCAR3细胞系FANCF基因沉默,可能为卵巢肿瘤基础和临床研究提供一种有效的方法。

长链非编码RNAAB073614的表达对卵巢上皮性癌细胞系OVCAR3细胞生物学行为的影响

卵巢上皮性癌（卵巢癌）是常见的妇科恶性肿瘤，是导致妇女恶性肿瘤相关死亡的常见病因，近年来其发病率呈上升趋势。早期卵巢癌缺乏典型的临床特征及特异性的诊断指标；作为目前临床上普遍接受的卵巢癌肿瘤标志物，

miRNA-20a促进卵巢癌细胞OVCAR3的转移

目的检测miRNA．20a对卵巢癌细胞系OVCAR3转移能力的影响。方法通过实时定量RT-PCR验证反义寡核苷酸与小干扰RNA封闭与过表达的效果，然后利用MTF、软琼脂集落形成和transwell侵袭实验检测封闭和过表达miRNA．20a对OVCAR3细胞增殖及转移能力的影响。结果封闭内源性miRNA-20a后，细胞活性基本不受影响，但集落形成能力和细胞的转移能力明显降低。过表达miRNA-20a后，细胞活性基本不受影响，但集落形成能力和细胞的转移能力明显升高。结论miRNA-20a可能参与了卵巢癌细胞OVCAR3的转移。

CXCR4抑制剂AMD3100对人卵巢癌OVCAR3细胞凋亡的影响

目的探讨CXCR4抑制剂AMD3100对卵巢癌细胞株OVCAR3凋亡水平及其相关蛋白表达水平的影响。方法采用免疫组织化学法检测人体卵巢癌恶性组标本中趋化因子受体4(CXCR4)、B淋巴细胞瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、Bax、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达,分析其与临床病理特征的关系。不同浓度AMD3100处理OVCAR3细胞后,利用流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot检测CXCR4、Bcl-2、Bax及caspase-3的表达情况。结果人体卵巢癌组织(恶性组)标本中CXCR4、Bcl-2较良性对照组表达升高,Bax较良性对照组表达降低(均P<0.05),caspase-3在两组中表达差异无统计学意义(P>0.05),恶性组中CXCR4与Bcl-2的表达呈正相关,与caspase-3呈负相关(r=0.480,-0.475,均P<0.05),Bax、Bcl-2两者表达无相关性(P>0.05);不同浓度AMD3100作用OVCAR3细胞后,Bax、caspase-3的表达增加,CXCR4及Bcl-2的表达降低,细胞的凋亡率增加,与空白对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 AMD3100抑制卵巢癌细胞株OVCAR3中CXCR4的表达,并能促进卵巢癌细胞的凋亡,其机制可能是通过阻断CXCR4后抑制凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,同时促进Bax、caspase-3表达实现的。