人OX40-Fc分子的构建、真核表达及活性研究

目的 构建人OX4 0 Fc基因的真核表达质粒 ,并表达有生物学活性的纯化人OX4 0 Fc融合蛋白。方法 从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法扩增OX4 0膜外区cDNA编码基因 ,并导入真核表达载体pcDNA3中。测序证实后 ,进行酶切并与人IgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中 ,采用脂质体法稳定转染COS 7细胞 ,用夹心ELISA检测其表达情况 ,经蛋白A亲和纯化 ,用SDS PAGE与Westernblotting进行鉴定。检测其对活化后Jurkat细胞增殖的抑制活性。结果 测序证实构建的OX4 0膜外区与OX4 0 FccDNA阅读框完整 ,连接部位序列正确 ;ELISA证实OX4 0 Fc蛋白的表达 ;SDS PAGE与Westernblotting证实其为OX4 0 Fc蛋白。增殖实验证明其对活化后的Jurkat细胞有抑制增殖作用。结论 成功构建了人OX4 0 Fc真核表达载体 ,并使有生物学活性的OX4 0 Fc融合蛋白在COS 7细胞上获得了稳定表达。

mOX40-hIgG1Fc真核表达载体的构建

目的构建mOX40-hIgG1Fc的真核表达载体。方法从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA,应用RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,将其插入pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒。进而从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,再利用pcDNA3.1-hIgG1Fc重组载体构建pcDNA3.1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体,并经PCR、限制性酶谱分析和测序分析进行证实。结果构建的pcDNA3.1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体,经PCR、限制性酶谱分析和测序分析,证实获得的hIgG1Fc段及mOX40胞外段基因均与国际生物信息资源库GenBank登录的相应基因序列完全一致。结论成功构建pcD-NA3.1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体,为OX40分子的进一步研究奠定良好的基础。

体外阻断CD134对LN患者外周血单个核细胞T_H1/T_H2细胞因子表达的影响

目的探讨CD134/CD134L共刺激分子对TH1/TH2细胞因子表达的影响及在狼疮性肾炎(LN)发病机制中的可能作用。方法活动期LN患者10例,分别采取外周静脉血,用密度梯度离心法制备新鲜PBMC,分成6组:(1)对照培养组;(2)单纯刺激组;(3)抗CD134组;(4)抗IL-4组;(5)rh-CD134∶Fc组;(6)地塞米松(Dex)组。另选取10例健康体检者作为健康对照组。采用ELISA法分别测定培养液上清中IFN-γ、IL-4、IL-10表达水平。结果(1)在抗CD3ε单抗PrIL-2刺激前,活动期LN患者PBMC培养液上清分泌的IFN-γ、IL-4和IL210水平都明显高于健康对照组;(2)在抗CD3ε单抗PrIL-2刺激下,活动期LN患者PBMC分泌的IFN2γ、IL-4和IL-10又较刺激前明显增加;(3)抗IL-4单抗、抗CD134单抗均可使经抗CD3ε单抗PrIL22刺激的LN患者PBMC分泌IL24、IL210水平显著下降,导致IFN2γ水平显著增高,免疫应答朝TH1方向偏离;(4)Dex能显著抑制抗CD3ε单抗PrIL22刺激的原代培养PBMC中IL24、IFN2γ的分泌水平,但对IL210的产生并没有明显的抑制或促进作用;(5)rhCD134∶Fc能显著降低抗CD3ε单抗PrIL-2刺激的原代培养PBMC中IFN-γ及IL-4、IL-10的分泌水平,对TH1和TH2细胞因子的产生都有显著抑制作用。结论糖皮质激素的抗炎机制具有多重性,对TH1、TH2细胞因子的作用并不均衡;抗CD134单抗对减轻LN患者PBMC的异常活化有一定作用;CD134-IgG融合蛋白与抗CD134单抗相比,抑制作用更明显,对急性期LN有更好的治疗作用。