OX40-IgG1融合基因重组表达载体的构建及鉴定

目的:构建含人OX40-IgG1融合基因的真核表达载体pDC315-OX40Ig,表达具有生物学活性的OX40Ig融合蛋白,为诱导异体复合组织移植免疫耐受的基因治疗作准备。方法:全基因合成目的基因OX40Ig,即人OX40胞外段序列及人IgG1 Fc段序列,将该片段插入到pUC57(+)载体后,亚克隆至真核表达载体pDC315(+),构建pDC315-OX40Ig重组质粒。构建的重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定后,用脂质体法转染于NI H/3T3细胞。以SDS-PAGE与Western Blotting检测细胞培养上清中OX40I g融合蛋白的表达情况;MTT法观察OX40Ig对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用。结果:合成的目的基因全长1320bp,构建的重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定正确。SDS-PAGE与West ern Blotting证实OX40Ig融合蛋白在3T3细胞中实现表达,表达产物相对分子量为48000左右,与理论预期值相符。体外实验证实OX40Ig蛋白能够抑制异基因淋巴细胞的MLR。结论:成功构建了人OX40-IgG1融合基因真核表达载体pDC315-OX40Ig,体外实验证实表达的OX40Ig蛋白可抑制淋巴细胞增殖,为干预同种异体复合组织移植排斥反应奠定了基础。

重组腺病毒载体AdOX40Ig的构建、表达及相关体外实验

目的:构建并鉴定含人OX40-IgG1融合基因的重组腺病毒载体,并感染人肝HL-7702细胞,筛选出最佳感染剂量并检测OX40Ig的表达情况,为进一步用于器官移植后的抗排斥治疗奠定基础。方法:根据基因库公布的人OX40和hIgG1 Fc片断序列设计特定引物,通过聚合酶链反应扩增并鉴定后,酶切插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中。随后与pAdeasy-1腺病毒质粒以氯化钙法共转化BJ5183感受态细胞,重组质粒经鉴定正确后,大量扩增为腺病毒载体。再经293A细胞包装、扩增并纯化后感染HL-7702肝细胞,筛选出最佳感染剂量,并采用间接免疫荧光法检测其中外源性OX40Ig基因的表达,采用ELISA法测定肝HL-7702细胞上清中OX40Ig蛋白的含量。结果:转移质粒pTOX40Ig经酶切及测序鉴定正确。重组腺病毒质粒经酶切鉴定正确,并成功转染了293A细胞。得到的病毒液经纯化扩增后进一步感染肝HL-7702细胞,经筛选,10 MOI为最佳感染剂量,并且可以检测到OX40Ig目的基因及其蛋白的表达。结论:成功构建了重组腺病毒载体AdOX40Ig,并且可在肝细胞HL-7702中表达相应的目的基因及蛋白。