慢性肾病Ⅲ~Ⅴ期患者血清Klotho,OTA和Bcl-3表达水平与疾病预后的相关性研究

目的研究慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)Ⅲ~Ⅴ期患者血清Klotho,赭曲霉毒素A(OTA)和B细胞淋巴瘤因子3(Bcl-3)水平,分析三者的临床预后价值。方法选取内蒙古包钢医院2018年1月~2019年1月期间收治的原发性CKDⅢ~Ⅴ期患者118例为研究对象(CKD组),以同期健康查体的健康者60例为对照组。应用酶联免疫吸附实验检测血清Klotho,OTA和Bcl-3表达水平。相关性分析采用Pearson相关分析。Kaplan-Meier生存分析不同血清Klotho,OTA和Bcl-3水平患者肾脏存活率的差异。单因素及多因素COX回归分析影响CKDⅢ~Ⅴ期患者肾脏结局事件发生的因素。结果CKD组患者血清Klotho(2.54±0.39 mg/L)低于对照组(8.24±1.30 mg/L),血清OTA(2.11±0.40 mg/L),Bcl-3(81.25±13.67 pmol/L)高于对照组(0.40±0.13 mg/L,48.14±10.28 pmol/L),差异均有统计学意义(t=43.996,32.111,16.526,均P<0.05)。不同CKD分期患者血清Klotho,OTA和Bcl-3水平比较,差异均具有统计学意义(F=206.071,48.544,60.466,均P<0.05)。CKD组患者血清Klotho与估计肾小球滤过率(eGFR)呈显著正相关(r=0.627,P<0.05),血清OTA,Bcl-3与eGFR呈显著负相关(r=-0.537,-0.489,均P<0.05),血清Klotho表达与OTA,Bcl-3表达呈显著负相关(r=-0.689,-0.703,均P<0.05)。低Klotho组肾脏存活率[44.83%(26/58)]低于高Klotho组[75.00%(45/60)],差异具有统计学意义(Log rankχ^(2)=6.988,P<0.05);高OTA组肾脏存活率[40.68%(24/59)]低于低OTA组[79.66%(47/59)],差异具有统计学意义(Log rankχ^(2)=7.247,P<0.05);高Bcl-3组肾脏存活率[46.67%(28/60)]低于低Bcl-3组[74.14%(43/58)],差异具有统计学意义(Log rankχ^(2)=7.198,P<0.05)。24h尿蛋白量(OR=1.602,95%CI=1.268~2.022),eGFR(OR=0.628,95%CI=0.493~0.799),血清Klotho(OR=0.577,95%CI=0.416~0.800),OTA(OR=2.061,95%CI=1.922~2.279)和Bcl-3(OR=1.809,95%CI=1.218~2.688)是影响CKDⅢ~Ⅴ期患者肾脏结局事件发生的独立因素。结论CKDⅢ~Ⅴ期患者血清Klotho降低,OTA,Bcl-3水平升高,三者血清水平与患者肾功能状况有关,有助于评估CKDⅢ~Ⅴ期患者的预后。

液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中赭曲霉毒素A、B的残留量

采用液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中赭曲霉毒素A、B的残留量。样品用氨水调节pH后离心,上清液过C18固相萃取柱净化,以甲醇洗脱,氮气吹至近干后用甲醇-0.15%甲酸（7＋3）溶液定容至1mL。以Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱为分离柱,以甲醇-含5mmol·L^-1乙酸铵溶液的0.15%甲酸溶液（7＋3）混合液为流动相进行洗脱,采用电喷雾离子源及选择多反应监测模式进行测定。赭曲霉毒素A、B的线性范围在10.0μg·L^-1以内,方法的测定下限（10S/N）均为2.0μg·L^-1。对空白样品进行加标回收试验,回收率在66.3%~87.4%之间,测定值的相对标准偏差（n=6）在5.2%~7.6%之间。方法用于葡萄酒中赭曲霉毒素A、B的测定,结果与美国化学家协会检测方法的测定结果一致。

液相色谱-串联质谱法测定宠物食品中赭曲霉毒素A和B

建立了同时测定宠物食品中赭曲霉毒素A和B的液相色谱-串联质谱分析方法。样品经乙腈/水(1∶1,V/V)提取,HLB固相萃取柱净化。采用Agilent ZOBRAX C_(18)柱(150×2.1mm,5μm)分离,以0.1%甲酸水溶液-乙腈作为流动相,梯度洗脱。目标化合物在多反应监测模式(MRM)下进行检测,外标法定量。在优化的条件下,赭曲霉毒素A和B在0.1~10.0ng·mL^(-1)范围内呈良好的线性关系,相关系数均不低于0.9993,方法定量限分别为0.1μg·kg^(-1)和0.05μg·kg^(-1)。方法平均回收率为78.3%~107.5%,相对标准偏差不大于9.5%。该方法前处理简单、选择性好、灵敏度高,可用于宠物食品中赭曲霉毒素A和B的测定。

抗赭曲霉毒素A五价纳米抗体的表达及分析

利用霍乱毒素B亚基(B subunit of Cholera toxin,CTB)能自组装形成五元环状结构,将霍乱毒素B亚基与纳米抗体(VHH28)进行融合从而达到纳米抗体多聚化的目的。将重组载体p ET25b(+)-CTB-VHH28转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,对诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间进行优化,SDS-PAGE凝胶电泳分析融合蛋白表达情况。结果显示CTB-VHH28为可溶表达,其中单体分子量大小约30 kDa,五聚体分子量大小约150 kDa,均与预测的分子量大小一致;确定了其最优表达条件为:IPTG浓度为0.05 mmol/L,诱导温度为16℃,诱导时间为10 h。经过镍柱纯化后成功得到了纯度较高的五价纳米抗体,表达量为20 mg/L。对其活性进行测定,结果表明CTB-VHH28能与赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)特异性结合,在2.5%甲醇条件下,间接竞争ELISA半抑制浓度(IC_(50))为0.38 ng/mL。热稳定性及甲醇耐受性结果显示,CTB-VHH28在25~55℃具有良好的热稳定性,反应体系中甲醇浓度低于20%时,竞争抑制率变化不大,具有较好的甲醇耐受性。结论:本研究所制备的五价纳米抗体可以用于OTA检测。