人重组Oct3/4真核表达载体构建及在卵巢癌细胞中的表达研究

目的构建人Oct3/4真核表达载体并转染人卵巢癌细胞株(SKOV3),观察Oct3/4在SKOV3稳定细胞株中的表达。方法采用RT-PCR技术扩增获得目的基因Oct3/4 cDNA产物,利用pcDNA3.1载体质粒构建人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,酶切及DNA测序鉴定。利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染SKOV3,以空载体转染细胞和未转染细胞作为转染对照组和阴性对照组。经G418(neomycin)筛选获得SKOV3稳定转染细胞株,Western blotting分析检测细胞Oct3/4蛋白的相对表达水平。结果 PCR扩增产物经12g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定目的基因条带大小约1000bp,与理论预期值一致。构建完成人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,DNA测序结果与GenBank数据库进行比对序列一致。Western blotting检测显示,转染pcDNA3.1-Oct3/4组稳定转染细胞中Oct3/4蛋白相对表达量(10.225±0.987)显著高于转染对照组(1.713±0.896)和阴性对照组(校正值为1)(P<0.01)。结论成功构建人重组Oct3/4真核表达载体并转染SKOV3,稳定转染细胞株中Oct3/4蛋白呈稳定过量表达。实验为进一步研究Oct3/4基因在卵巢癌发生、发展及耐药机制中的作用奠定了基础。