苹果坏死花叶病毒CP基因原核表达及其抗血清制备

苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是近年新发现的病原物,并且是与我国苹果花叶病症状高度相关的重要病毒,进行ApNMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因原核表达、制备多克隆抗血清,以建立快速、灵敏、准确的ApNMV常规检测方法尤为必要.通过设计特异性引物,以RT-PCR方法成功获得ApNMV CP基因序列,插入到原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG进行重组蛋白(含His-tag)诱导表达.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,用Ni Sepharose 6 Fast Flow进行蛋白纯化,回收共得到重组蛋白2.4 mg.在屏障环境下免疫2只SPF级新西兰兔,制备出多克隆抗血清,稀释400倍后仍能与ApNMV阳性苹果叶片样品发生免疫反应.由此证明,本研究建立的ApNMV间接ELISA检测方法具有较好的灵敏性,检测效率高,能够用于田间大量样品ApNMV的诊断.

玫瑰叶畸形病毒外壳蛋白基因原核表达与抗血清制备

玫瑰叶畸形病毒(rosa rugosa leaf distortion virus,RrLDV)属于番茄丛矮病毒科Tombusviridae天竺葵环斑病毒属Pelarspovirus,能够引起月季叶片畸形、黄化以及提前衰老等症状,是危害月季的病毒之一。为建立玫瑰叶畸形病毒的快速检测方法,采用热硼酸盐法提取发病月季叶片总RNA,通过RT-PCR扩增该病毒外壳蛋白基因,连接至原核表达载体pDB-His-MBP上,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21以IPTG,诱导蛋白表达,获得浓度为8 mg/mL的重组蛋白,制备了兔多抗血清。Western blot检测血清效价为1∶2048000,当效价为1∶1000时,灵敏度为1∶1024。血清学检测结果与RT-PCR检测结果一致,表明该抗血清可用于RrLDV的检测,有利于检测该病毒的发生和分布。

Variation in the Coat Protein Gene of Papaya ringspot Virus Isolates from Multiple Locations of China

The potyvirus Papaya ringspot virus （PRSV） is an important pathogen of papaya that causes severe losses in economic crops for papaya production globally. The coat protein （CP） genes of five PRSV isolates originating from different locations in China were cloned and sequenced. The CP-coding region varied in size from 864-873 nucleotides, encoding proteins of 288-291 amino acids. The five Chinese isolates of PRSV have been characterized as papaya-infecting （PRSV-P）. The CP sequences of the Chinese isolates were compared with those of previously published PRSV isolates originating from different countries at amino acid levels. A number of KE repeat boxes in the N terminus of the PRSV-CP were found in all Chinese isolates. The phylogenetic branching pattern revealed that there was certain extended grouping between geographic locations, and the Asian type probably represents the oldest population of PRSV. The information of CP genes will be useful in designing and developing durable virus resistant-PRSV transgenic papaya in China. Meanwhile broad-spectrum-virus resistant, strongly resistant-PRSV and good safe papaya lines are required.

李属坏死环斑病毒扬州分离物CP基因的原核表达及抗血清制备

李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)严重危害蔷薇科植物,在世界范围内普遍分布。为建立快速有效的PNRSV检测方法,依据PNRSV CP基因序列设计引物,并从桃叶片上扩增PNRSV-CP片段,将双酶切产物插入原核表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a-CP^(PNRSV),转化大肠埃希菌Rosetta菌株,IPTG诱导重组蛋白表达。SDS-PAGE电泳检测显示,在分子量约25 ku处有蛋白质条带,符合预期大小。镍柱亲和纯化PNRSV CP蛋白,以其纯化蛋白质免疫健康新西兰白兔,制备多克隆抗血清。Western blot、ELISA、Dot blot检测结果显示,制备的抗血清能检测到PNRSV CP基因在感病植物叶片中表达,而在健康植株中未检测到;制备的抗血清滴度稀释至1∶64000时,仍能与纯化蛋白质发生特异性反应。综上,制备的PNRSV抗血清特异性强、效价高,可用于PNRSV的快速检测。

齿兰环斑病毒RT-qPCR检测方法的建立

【目的】针对齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)建立快速、有效检测方法,对于保障兰花规模化生产有重要意义。【方法】以齿兰环斑病毒为材料,根据NCBI上已登录的齿兰环斑病毒外壳蛋白(coat protein,cp)基因序列分析其序列保守区,使用Primer Premier 5.0设计反转录荧光定量PCR引物及TaqMan荧光探针,建立检测齿兰环斑病毒的一步法RT-qPCR。构建齿兰环斑病毒cp基因克隆质粒,并以该质粒作为标准品进行荧光定量PCR标准曲线测定;以齿兰环斑病毒、建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的病毒RNA为模板进行一步法RT-qPCR特异性检测;以10倍倍比稀释的cp基因质粒为模板进行灵敏性检测;用该法对大田18个兰花样品进行齿兰环斑病毒感染情况监测。【结果】齿兰环斑病毒一步法RT-qPCR检测法仅检出齿兰环斑病毒阳性模板,其余模板检测结果为阴性,说明检测方法具有特异性;该方法能够检测到的齿兰环斑病毒cp基因最低拷贝数为130;大田兰花样品感染齿兰环斑病毒的检出率为100%。【结论】一步法RT-qPCR是一种特异性强、灵敏度高,且适合监测实际生产过程中兰花感染齿兰环斑病毒情况的检测方法。

广东地区两种兰花病毒病害的分子鉴定及检测

根据已报道的建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)基因组核苷酸序列,在其cp基因上下游设计PCR引物。CyMV预计扩增产物784bp,ORSV预计扩增产物604bp。以采集自广东省顺德的墨兰和文心兰表现病毒病症状的病株叶组织总RNA为模板,进行RT-PCR扩增。对预期大小的5个扩增产物进行克隆和测序,结果表明,来源于不同兰种或同一兰种不同兰场的病样CyMV引物扩增产物核苷酸序列存在少量差异,但均与世界各地的CyMV分离物cp基因高度同源;而来源于不同兰种的病样ORSV引物扩增产物核苷酸序列完全相同,与世界各地的ORSV分离物cp基因高度同源。因此可将侵染广东兰花的两种病毒鉴定为CyMV和ORSV。混合上述两种病毒的 PCR引物,采用双重RT-PCR扩增,对采自广东顺德23个兰场共153份样品进行病毒检测,76份(49.7%)检出CyMV,52份(34.0%)检出ORSV,2份(1.3%)同时检出CyMV和ORSV。

马铃薯X病毒CP基因的原核表达及特异性抗血清的制备

依据马铃薯X病毒(PotatovirusX,PVX)外壳蛋白(CP)基因序列(711bp)设计合成了两对引物,通过RT-PCR扩增得到长0.7bp的目的片段.将目的片段转入大肠杆菌,酶切鉴定证明得到了含有目的片段的重组子,测定序列结果与其他PVX分离物CP基因序列比较,发现其核苷酸同源性最高可达99%左右,证明此病毒为PVX.构建了含PVXCP基因的融合蛋白原核表达载体,并在大肠杆菌中得到表达,SDS-PAGE测定该融合蛋白GST-XCP的相对分子质量为52000.Westemblot分析结果显示,GST-XCP与PVX抗血清有很强的免疫反应,表明GST-XCP有天然状态下病毒核衣壳蛋白的抗原性.制备了GST-XCP抗血清,并利用此抗血清建立了PVX的间接ELISA检测方法,检测灵敏度为1mg鲜重的病株叶片.

齿兰环斑病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

齿兰环斑病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析刘志昕潘俊松邵寒霜郑学勤（中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室，海南儋州５７１７３７）关键词齿兰环斑病毒，外壳蛋白基因，序列分析兰花受病毒危害相当严重，齿兰环斑病毒（Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｕｍｒｉｎｇｓ...

白草花叶病毒CP基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

将白草花叶病毒(Penn isetum mosaic virus,PenMV)的外壳蛋白(CP)基因连接到表达载体pET22b(+)上,获得重组子pET-PCP。SDS-PAGE和W estern b lotting分析表明,经IPTG诱导后,含pET-PCP的大肠杆菌BL21(DE3)pLys产生分子量为36 kDa的融合蛋白。以N i2+亲和层析柱纯化该蛋白,并以其为抗原免疫德国大白兔制备了特异性较强的抗血清。微量免疫沉淀法测其效价为1∶1 024,酶联法(enzym e-linked immunosorbant assay,ELISA)测定的效价为1∶8 192。该血清可替代常规病毒粒子所制备的抗血清,用于检测PenMV。

烟草蚀纹病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

根据烟草蚀纹病毒(TEV)CP序列设计合成上下游引物,利用RT-PCR方法获得了TEV CP基因,大小为789 bp。将TEV CP基因克隆到pM D 18-T S im p le V ector,经E coRⅠ/S acⅠ双酶切得到目的片段,并将其定向插入到pET 30a载体中构建了原核表达载体pET 30-TEV CP,重组质粒经E coRⅠ和S acⅠ双酶切鉴定及基因测序验证正确后,转化大肠杆菌BL 21,用IPTG进行诱导表达。结果表明,TEV CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,分子量约为37 ku。以表达产物为抗原免疫家兔,制备了特异性抗血清,其效价为1/1 204。W estern b lot检测结果表明,制备的抗血清可用于检测田间的发病植株。

贵州齿兰环斑病毒的分子鉴定

为有效地控制贵州兰花的病毒，将经ELISA方法检测为齿兰环斑病毒（ORSV）阳性的蝴蝶兰样品摩擦接种至其枯斑寄主苋色藜进行纯化，RT-PCR 克隆并连接至 pMD18-T 载体后测序，用 DNA-MAN7．0和MEGA5．0软件进行核苷酸序列分析。结果表明：成功克隆该病毒CP基因，其序列长度为477 bp，编码158个氨基酸残基；序列同源性分析显示，该分离物的CP基因与已报道的11种ORSV各地分离物序列同源性高达96％～99％，而与同属其他3种病毒CP基因同源性均低于70％。证明，贵州蝴蝶兰上感染的病毒为 ORSV。

番木瓜环斑病毒畸叶株系的CP基因克隆和序列分析

采用RT PCR方法合成了本研究室保存的番木瓜畸叶病毒 (PMaLV)的外壳蛋白 (CP)基因 ,将其CP基因克隆进Promega公司的pGEM -TandpGEM -TEasyVectorSystem(简称T -载体 ) ,并进行了序列分析。结果表明 ,PMaLVCP基因核苷酸序列全长为 86 1nt,推导其编码 2 87个氨基酸。与番木瓜环斑病毒 (PRSV)美国夏威夷HA株系和澳大利亚W株系的CP基因相比 ,在第 6 6nt处开始连续缺失 3个核苷酸。与PRSV的华南Ys、Sm和G株系以及夏威夷的HA和澳大利亚的W株系相比 ,其CP基因序列同源率分别为 96 %、98%、95 %、89%和 89%。其推导的氨基酸序列同源率分别为 98%、97%、97%、96 %和 95 %。此结果表明 ,PMaLV属于PRSV的一个株系 ,不是一种新病毒。因此 ,我们称其为番木瓜环斑病毒畸叶株系 (ML株系 )。

齿兰环斑病毒外壳蛋白基因的表达及其表达产物抗血清的制备

用pET－21d构建齿兰环斑病毒（ORSV）外壳蛋白基因大肠杆菌表达载体pEO。经SDS－PAGE和Westernblotting分析，含pEO的大肠杆菌正确表达了ORSV外壳蛋白基因。此表达产物为融合蛋白。用表达产物制备抗血清，并应用于间接酶联法检测ORSV，具有较高的灵敏度（10ng／mLORSV）和特异性。

转基因番木瓜研究进展

番木瓜环斑病毒 (PRSV)使热带亚热带的重要水果番木瓜的生产受到严重影响 ,在众多方法防效不佳的情况下 ,利用病原获得抗性防治PRSV给番木瓜的生产带来了光明。综述了近年来转PRSVCP基因番木瓜中影响番木瓜转化因素和转基因番木瓜的抗性因素。转PRSV外壳蛋白 (CP)基因的番木瓜中多以胚性组织为转化材料 ,被转化材料的生理状态和基因型 ,是影响转化效率和转基因植株质量的主要因素。所获得的转基因番木瓜对PRSV的抗性在很大程度上依赖于接种PRSV与所转化PRSVCP基因的序列同源性、转基因拷贝数和所转基因的位置等。

齿兰环斑病毒CP基因的原核表达及其产物抗血清制备

本研究在于探讨侵染兰花的重要病毒之一齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)CP基因的原核表达及其产物抗血清制备技术。从福建省漳州市采集感染齿兰环斑病毒的建兰病样,设计一对特异性引物扩增并克隆得到该病毒的外壳蛋白基因,该基因开放阅读框长477bp,编码158aa约合18.0kDa的蛋白质,随后将目的基因插入pET-29a(+)中构建相应的原核表达载体进行诱导表达,目的蛋白经纯化后免疫家兔获得了特异性抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的ORSV外壳蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附检测结果表明,抗血清可检测阳性病汁液的最低稀释度达1:25600(v/v),最佳工作浓度为1:12800(v/v),阳性病汁液灵敏度为0.195mg/mL(w/v),而与TMV等11种同源或异源病毒均无明显的血清学交叉反应。

烟草脉带花叶病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

利用马铃薯Y病毒属病毒的简并引物,通过RT-PCR技术获得了云南烟草病毒分离物YND的3′端约1.7 kb片段,序列分析证明该分离物为烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV)。将TVBMVcp基因克隆到表达载体pET-22b(+)上,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出分子量为35.0 kD的融合蛋白。利用该融合蛋白制备了TVBMV的多克隆抗体,ELISA测定抗血清效价为1/4 096。Western blotting和DIBA分析结果表明,获得的抗血清和原核表达的病毒蛋白及植物病汁液中的病毒均有特异性反应,可用于TVBMV的快速检测。

西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT—PCR方法获得了西瓜花叶病毒（WMV）陕西分离物外壳蛋白（CP）基因，大小为843bp．将CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector，测序分析发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93．0％～95．0％和96．5％～98．6％．将CP基因定向插入EcoR Ⅰ／Sal Ⅰ切开的pET30a中，构建了原核表达载体pET30-WCP，转化大肠杆菌BL21．经IPTG诱导2～8h后，成功表达了分子量约为37kD的CP蛋白．通过不同时间诱导发现，加入IPTG4h后蛋白开始表达，8h后表达量比较大．以诱导的蛋白为抗原免疫家兔，制备了WMV CP抗血清，ELISA法测其效价为1／6400，Western blot分析能与CP发生血清学反应．

烟草环斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)是我国二类进境检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大.本研究依据TRSV外壳蛋白基因cp序列设计合成了2条引物,通过RT PCR扩增得到长约1500bp的目的片段.将目的片段与质粒pET-22b(+)连接,构建了含TRSV cp基因的融合蛋白原核表达载体pETRSV-CP.序列分析表明,TRSV-SD1的cp基因全长1548bp,编码515个氨基酸与GenBank中其它TRSV分离物cp基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为90.7%～94.6%.将pETRSV-CP转入大肠杆菌,诱导表达.SDS-PAGE结果显示,表达的TRSV CP融合蛋白的相对分子质量约为58kDa.以此融合蛋白制备的抗血清的效价为1/1024,抗血清与TRSV具有良好的特异性反应.

大麦条纹花叶病毒中国株CP基因克隆分析、原核表达及抗血清制备

首次用PCR方法，自大麦条纹花叶病毒中国株（BSMV-CH）的RNA2（GenBank登录号为：AY789694，未报道）中扩增出外壳蛋白（coat protein，CP）基因，并亚克隆到pMD18-T载体上进行测序分析。结果表明BSMV—CH的CP全长597bp，它与BSMV其它株系CP的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为93．1％～93．8％和91．4％-92．4％；与同属的早熟禾半潜病毒（PSLV）和剪秋罗环斑病毒（LRSV）的核苷酸同源性分别为53．0％和41．8％，氨基酸同源性分别为48．1％和40．0％。根据大麦病毒属病毒已经报道的CP氨基酸序列绘制系统发育树，分析表明分离的各毒株在进化上存在明显地理位置的相关性。把CP基因亚克隆到GST融合表达载体pEGX-6p-1上，优化IFFG诱导终浓度后，在37℃ IFFG终浓度为1．0mmol/L时，融合蛋白GST-CP在大肠杆菌BL21中得到了特异表达。12％SDS—PAGE表明，表达产物大小为48．5kDa，主要以包含体形式存在。对蛋白进行定量后，用冰冷的KCl显色，分离表达的蛋白质特异条带制备抗原，免疫家兔得到抗血清，酶联法（enzyme-linked immunosorbant assay，ELISA）测定的抗血清效价为1／6400。用抗血清对感病大麦和健康大麦进行检测，结果表明抗血清有很高特异性。

蝴蝶兰2种病毒的同步检测及其CP融合反义表达载体构建

【目的】建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)是侵染蝴蝶兰最主要的2种病毒,给蝴蝶兰产业造成巨大经济损失。本文建立了快速检测这2种病毒的方法,并为培育同时抗CyMV和ORSV的蝴蝶兰新品种奠定基础。【方法】根据2种病毒CP基因序列设计了2对特异性引物,运用RT-PCR方法同时检测这2种病毒,利用反义RNA技术构建2种病毒CP基因的融合表达载体。【结果】利用设计的特异性引物检测12株蝴蝶兰样品,有25%同时检测出2种病毒,在同一PCR反应体系中,扩增出2个目的条带清晰无杂带。从感病蝴蝶兰叶片总RNA中克隆出CyMV CP基因的125 bp片段和ORSV CP基因的164 bp片段。将CyMV的CP基因片段以3’→5’方向与表达载体p CAMBIA1300连接,命名为p CAMBIA1300-CyMV,经酶切及菌落PCR鉴定可获得125 bp的小片段;再将ORSV的CP基因片段以3’→5’方向与p CAMBIA1300-CyMV连接,命名p CAMBIA1300-CyMV-ORSV,经酶切及菌落PCR鉴定可获得289 bp的片段。【结论】所设计的2对特异性引物能够在同一PCR体系中快速高效地检测出CyMV和ORSV,含2种病毒CP基因的反义融合表达载体构建成功。