新型bcl-2基因反义寡核苷酸F951诱导人白血病HL60细胞凋亡

目的观察新型bcl-2反义寡核苷酸F951诱导人白血病细胞凋亡的作用。方法不同浓度的F951与HL60细胞共培养后,采用流式细胞术,DNA Ladder分析,电镜观察,TdT酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞。结果5,10,20μmol.L-1F951分别与HL60细胞共孵育48h后,线粒体凋亡细胞:未处理组、FNS对照组分别为3.00%、13.57%,F9513个剂量分别为30.95%、38.08%、52.55%;Caspase活性细胞:未处理组、FNS对照组分别为0.08%、0.14%,F9513个剂量组分别为43.68%、60.54%、80.37%。凝胶电泳分析:F951处理组可见典型的DNALadder,且随着药物浓度的提高诱导DNA Ladder的作用更加明显;TUNEL和电镜检查:未处理组与FNS对照组中仅偶见凋亡细胞,F951各剂量组凋亡细胞常见,且随着药物浓度的提高凋亡细胞增多。结论F951具有诱导HL60细胞凋亡的作用;F951诱导肿瘤细胞凋亡的作用是通过抑制bcl-2基因,启动细胞凋亡调控通道而实现的。

PDGF-α受体反义寡核苷酸治疗实验性增生性玻璃体视网膜病变

目的探讨血小板源性生长因子α受体(platelet-derived growth factor receptorα,PDGFR-α)反义寡核苷酸治疗实验性增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的效果。方法选择健康成年有色家兔24只(48眼),右眼分别行玻璃体内注射人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelium,HRPE)稀释液(8只8眼,A组)、1.0与2.0μmol·L-1含PDGFR-α反义寡核苷酸及LipofectamineTM2000的HRPE细胞稀释液(各8只8眼,B组和C组)。左眼分别注射平衡盐溶液(balanced salt solution,BSS)0.1 mL作为正常对照组。造模后1周、2周、3周、4周间接眼底镜观察PVR程度;处死动物后,进行组织病理学观察眼底改变及免疫组织化学染色观察切片着色情况。结果造模前后正常对照组兔眼玻璃体透明,视网膜结构清楚;造模后28 d,A组兔眼玻璃体内可见粗大增生的条索及视网膜脱离,B组和C组严重度低于A组。在造模后1周、2周,PVR分级在所有组之间差异均无统计学意义(均为P>0.05);在3周、4周时,B组和C组的PVR分级明显低于A组(均为P<0.05)。造模后4周,B组TRD发生率(50%)和C组TRD发生率(38%)与A组(100%)相比,差异均有统计学意义(均为P<0.05);B组与C组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。组织病理学检查显示:造模后4周正常对照组全层结构清晰,A组兔视网膜内界膜粗糙、断裂或结构不清,各层结构欠清,神经节细胞水肿,出现空泡,数量减少,B组和C组严重度低于A组。免疫组织化学检查显示:A组视网膜全层细胞及增生的纤维组织内呈高强度棕黄色着色(++++),B组呈中等强度棕黄色着色(+++),C组呈较弱棕黄色着色(++);正常对照组视网膜表层神经节细胞、RPE内可见弱棕黄色着色(+)。结论 PDGFR-α反义寡核苷酸可降低PVR形成程度,这可能与下调视网膜细胞中PDGF-α浓度有关。

预防血管成形术后再狭窄的C-sis反义寡脱氧核苷酸在血清中的稳定性

目的 探讨自行设计合成的C-sis癌基因反义寡脱氧核苷酸(AODN)和C-sis癌基因反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(PS-AODN)血清稳定性。方法 用小牛血清模拟体内条件于不同时相点进行稳定性试验,用高效液相色谱法测定血清中AODN和FS-ODN。结果 AODN在血清中1小时内降解43.3％,1天降解53.1％。PS-ODN 1 h降解23.7％,第6天降解59.6％。PS-AODN血清中的稳定性明显高于AODN。结论 PS-AODN在血清中有较好的稳定性,提示其具有潜在的临床应用价值。

HBVPreS_2反义脱氧寡核苷酸对HepG2.2.15细胞系恶性表型的影响

目的:研制新型的抗肝癌药物,观察反义脱氧寡核苷酸(asON)对整合乙型肝炎病毒(HBV)的HepG2.2.15细胞系端粒酶活性及癌基因C-myc和N-ras蛋白表达的影响。方法:设计合成针对HBVPreS2基因翻译起始区的asON,并设非互补序列作对照,以肝癌细胞系HepG2.2.15为细胞模型,asON以10μmol/L浓度用药,用ELISA法观察了细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的变化;MTT法检测asON对细胞毒性作用;放射免疫方法检测细胞培养上清液中血清铁蛋白浓度;用银染—Trap法测定asON对HepG2.2.15细胞端粒酶活性的影响;免疫细胞化学染色检测asON对癌基因C-myc和N-ras蛋白表达的影响。结果:asON能有效地抑制HBV抗原表达,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为66%和91%。而asON以20或40μmol/L浓度用药4d对宿主细胞无毒性作用,asON以10μmol/L浓度用药后第2天用药组和对照组血清铁蛋白浓度分别为(28.26±0.02)ng/ml和(28.14±0.02)ng/ml,两者相比无统计学意义(P>0.05)。用药后第3天asON组比对照组端粒酶活性降低;用药后第3天C-myc和N-ras蛋白表达降低,和对照组相比有统计学意义(P<0.05)。结论:该段asON不仅抑制HBV抗原表达,而且抑制肝癌细胞的恶性表型而对宿主细胞无毒性,有可能成为有前途的抗肝细胞肝癌新药。

反义寡核苷酸片段可抑制鲫鱼视网膜电压依赖性钾离子通道的表达

爪蟾卵母细胞经注射鲫鱼（Ｃａｒａｓｓｉｕｓｃａｒａｓｓｉｕｓ）视网膜总ＲＮＡ后，可表达大量电压依赖性钾离子通道。在此基础上，我们进一步发现，一个特定序列的寡核着酸能专一地抑止该通道的表达。由于我们设计与合成的该片段与果蝇、小鼠中已克隆的钾通道中编码Ｎ端的一个多肽的ｍＲＮＡ完全互补，因此推测：鲫鱼视网膜中的Ｋ＋通道基因这个区域与其它物种的Ｋ＋通道有高度同源性，这为克隆该基因和研究它的功能提供了重要资料。

培养人眼小梁细胞水通道蛋白1与Na^+-K^+-ATP酶、Ca^(2+)-ATP酶的相关研究

目的探讨人眼小梁细胞上水通道蛋白1(aquaporin-1,AQP1)与Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的相关关系。方法培养的人眼小梁细胞分别给予地塞米松(dexamethasone,DEX)0.4μg/mL(B组)、DEX0.4μg/mL+AQP1反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,AS-ODN)0.625μg/mL(C组)、DEX0.4μg/mL+AS-ODN 1.25μg/mL(D组)、DEX0.4μg/mL+AS-ODN 2.5μg/mL(E组)、DEX0.4μg/mL+AS-ODN 5μg/mL(F组)处理,以不加药组为对照组(A组)。5d后测定各组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性。结果与对照组的相比,DEX0.4μg/mL组Na+-K+-ATP酶活性、Ca2+-ATP酶活性明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。在各DEX+AS-ODN组,随着AS-ODN浓度加大,小梁细胞Na+-K+-ATP酶的活性逐渐提升。在AS-ODN浓度加到5μg/mL时,Na+-K+-ATP酶的活性恢复到最大。B、C、D、E组Na+-K+-ATP酶的活性与对照组及F组差异均有统计学意义(P<0.05),F组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。B、C、D、E、F组Ca2+-ATP酶活性与对照组差异均有统计学意义(P<0.05),B、C、D、E、F组之间Ca2+-ATP酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论人眼小梁细胞AQP1与Na+-K+-ATP酶关系密切,与Ca2+-ATP酶关系不显著,AQP1的正常表达是Na+-K+-ATP酶活性维持的必要条件之一。

槲皮素联合survivin反义核苷酸对肝癌SMMC7721/ADM细胞MDR的逆转作用

目的探讨槲皮素与survivin反义核苷酸(ASODN)联合应用对肝癌SMMC7721/ADM细胞多药耐药(MDR)的逆转作用。方法选择肝癌敏感细胞株SMMC7721和MDR细胞株SMMC7721/阿霉素(ADM),观察其对四种不同化疗药物的耐药性及槲皮素、survivin反义核苷酸(ASODN)对SMMC7721/ADM细胞MDR的逆转效果。结果槲皮素和ASODN联合时较两者单独应用时能显著降低四种化疗药物对SMMC7721/ADM细胞的半数抑制浓度(IC50)(P<0.05)。槲皮素单独应用及联合ASODN时均能明显降低SMMC7721/ADM细胞的多药耐药基因1(MDR1)mRNA及p170和多药耐药相关蛋白基因(MRP)mRNA及p190的表达(P均<0.05)。结论槲皮素与ASODN联合能明显逆转SMMC7721/ADM细胞对四种化疗药物的耐药性。槲皮素可能通过抑制MDR1 mRNA和MRP mRNA的表达使p170和p190的合成减少而发挥耐药逆转作用,ASODN不能通过该途径发挥作用。

高压诱导大鼠系膜细胞细胞外基质积聚机制及阿托伐他汀的干预作用

目的探讨高压诱导大鼠系膜细胞细胞外基质(ECM)积聚的可能途径,并观察阿托伐他汀的干预作用。方法将8～15代大鼠系膜细胞置于80mmHg高压下培养6、12、24、48h。并进一步分为阿托伐他汀组、TGF—β1反义寡核苷酸组、助溶剂二甲基亚砜(DMSO)对照组、错义寡核苷酸对照组及正常对照组。放射免疫法测定AngⅡ浓度。RT—PCR法测定TGF—β1、胶原纤维(Col)Ⅰ(α1)及纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1mRNA表达量。Western印迹法测定上述各指标蛋白表达。结果阿托伐他汀能显著降低AngⅡ水平。TGF—β1反义寡核苷酸对AngⅡ水平无显著影响。阿托伐他汀和TGF-β1反义寡核苷酸均能明显降低TGF—β1、colⅠ(α1)及PAI-1mRNA和蛋白水平。错义寡核苷酸和二甲基亚砜对上述指标表达水平无显著影响。结论AngⅡ和TGF—β1参与高压诱导ECM的积聚过程。AngⅡ的作用由TGF—β1介导实现,即存在“压力→AngⅡ→TGF-β1→ECM积聚”作用途径。阿托伐他汀在一定程度上逆转高压诱导的ECM积聚,此作用可通过干预上述途径实现。