形成三螺旋DNA的寡核苷酸抑制内皮细胞组织因子基因的表达

为探讨形成三螺旋DNA的寡核苷酸是否对切应力诱导内皮细胞组织因子基因表达有抑制作用 ,针对内皮细胞组织因子基因启动子内切应力反应元件 ,设计反向脱氧寡核苷酸序列T2 1GTa,采用固相亚磷酰胺三酯固相法合成脱氧寡核苷酸。在脱氧寡核苷酸的 3’末端进行硫代磷酸酯修饰。应用电泳迁移分析观察寡核苷酸和硫代脱氧寡核苷酸的亲和性。在ECV30 4内皮细胞株观察γ 32P标记硫代磷酸酯三螺旋DNA寡核苷酸的细胞摄取及其对组织因子基因表达的影响。结果发现 ,硫代磷酸酯寡核苷酸T2 1GTa ps与靶序列能形成三链DNA ,其Kd值为 3 .6× 1 0 1 0 mol L。在内皮细胞株ECV30 4细胞 ,三螺旋DNA寡核苷酸 ps (T2 1GTa ps)的细胞吸收率为 1 1 .65 % ,主要分布在核沉淀 ,约占吸收总量的 77.2 5 % ,显著降低内皮细胞组织因子基因mRNA表达及组织因子蛋白合成的平均吸光度值 ,显著降低组织因子的促凝活性。此结果提示 ,硫代磷酸酯寡核苷酸T2 1GTa

三螺旋结构寡核苷酸序列对DHBV基因的连接及封锁抑制作用研究

目的 筛选与鸭乙肝病毒 (DHBV) DNAX C区目标基因特异连接的三螺旋结构寡核苷酸(TFO) ,探讨TFO对DHBV DNA的特异连接及抑制作用。方法 将人工合成的TFO与目标基因片断和含(DHBV)DNA的重组细胞反应 ,用电泳转移印迹、PCR和鸭肝原代细胞培养等技术观察TFO对相应基因的连接以及对细胞内DHBV DNA复制的抑制效应。结果 在所设计的多条TFO中 ,( 3 )TFO和 ( 5 )TFO在 3～ 4h内能与细胞内外目标基因双链直接连接 ,导致DHBV DNA复制一定程度的抑制 ;在DHBV DNA阳性的原代鸭肝细胞培养液中连续加入终浓度为 4μmol L的TFO ,大多数细胞组的培养液中DHBV DNA的检测在 10～12d开始呈现阴性。结论 TFO能直接与病毒的DNA连接 ,导致目标基因的复制抑制 ,有着潜在的特异抗病毒价值。

生物靶标光敏剂对鸭乙肝病毒的特异结合及杀灭作用研究

目的 :利用生物靶标效应的原理 ,探索一种特异灭活病毒的光化学方法。方法 :将针对鸭乙肝病毒 (DHBV)设计并人工合成的两条三螺旋结构寡核苷酸 (TFO)分别标记 8-甲氧基补骨脂素 (8-MOP) ,并将这种复合物 (TFO -P)与长波紫外线 (UVA)共同作用于血液中的DHBV ,通过原代细胞感染、酶联免疫测定、DNA斑点杂交等试验 ,观察在一定作用条件下 ,TFO -P对DHBV-DNA的特异结合及其所产生的特异光敏效应对DHBV的灭活程度。结果 :DHBV -DNA样品斑点印迹随TFO -P含量的增加明显增强 ,而同时处理的血液中的白细胞DNA样品斑点印迹无明显增强 ;在TFO -P的加入量为 0 1nmol/ml,UVA照射强度为180 0 μW /cm2 时 ,5～ 2 0min的UV照射可灭活DHBV 1 90～ 6 4个对数级 ,灭活病毒的效率显著高于UVA和 8-MOP的单独作用时的效果。结论 :TFO -P与血液中DHBV -DNA能特异结合 ,在适宜的处理条件下 ,所产生的光敏效应能有效灭活血液中的DHBV ,灭活滴度可达

8-MOP的光敏反应对DNA特定位置的致损伤作用

目的:探讨末端标记8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)的三螺旋结构寡核苷酸(TFO)对鸭乙肝病毒(DHBV)-DNAX/C区一目标基因的特异结合及定位损伤作用。材料方法:在一定条件下,将人工合成的3’末端标记有8-MOP的TFO与目标双链基因片断反应,用电泳转移杂交印迹和PCR法观察设计的复合物(TFO-P)对目标基因的结合以及在长波紫外线(UVA)的照射下8-MOP所致DNA交联及引起的PCR扩增阻止效应。结果:所设计合成的TFO-P能与细胞外DHBV-DNA的目标基因双链直接结合,随TFO-P含量的增加,TFO-P与目标双链形成的三聚体分子的产量明显增加;TFO-P与目标基因的反应物经一定剂量的320～380nmUVA照射后,目标序列的PCR扩增出现阻断现象。结论TFO-P能直接与目标DNA特异结合,形成三聚体产物,在UVA的进一步作用下,TFO-P能在目标序列的设定位置发生光敏反应,使DNA形成共价交联结构。

抗乙型肝炎病毒基因治疗的若干进展

随着分子生物学特别是基因工程技术的发展 ,抗乙型肝炎病毒基因治疗有较深入的研究 ,利用基因重组、转基因及反义核酸等技术 ,在细胞水平或通过动物实验阶段的研究 ,基因有关治疗在抗乙肝病毒、抑制乙肝病毒复制中的作用已被证实。本文对转基因干扰素、DNA疫苗 (DNA免疫 )、反义寡核苷酸、三螺旋形成寡核苷酸 (反基因寡核苷酸 )。

靶向光敏剂对细胞内DHBV的特异灭活作用

为观察特异光敏剂对红细胞悬液中细胞内DHBV的抑制作用,探索全血病毒灭活方法。将设计、合成末端标记光敏剂的三螺旋结构寡核苷酸序列(TFO-P),以适当剂量加入模拟的病毒污染血液,在UVA(长波紫外线)的协同下处理血液;以PCR技术检测细胞培养的上清液中的DHBV-DNA,以组织原位杂交技术检测原代细胞内的DHBV,观察被处理前后肝原代细胞内DHBV的活性。结果,在经0.1nmol/ml TFO-P和1800μW/cm^2UVA照射10min后,分离、培养的鸭肝细胞上清液内检不出DHBV-DNA,细胞内DHBV-DNA在第7日转阴,而对照组的培养液和细胞内均可检出DHBV-DNA。结论,试验所设计的特异光敏剂能有效抑制血细胞悬液中细胞内的DHBV。

合成寡核苷酸对病毒目标序列特异结合反应及其影响因素研究

目的 观察人工合成的反义寡核苷酸 (ASON)、三螺旋结构寡核苷酸 (TFO)分别对人甲肝病毒 (HAV) 5′非编码区和鸭乙肝病毒 (DHBV) DNAX C区目标基因序列特异结合效应及受影响因素作用的变化。方法 在设定条件下 ,将人工合成的ASON和TFO与目标基因片断混合反应 ,采用电泳转移印迹技术观察特异结合产物及其产量。结果 所设计的ASON与TFO能与目标基因片段直接特异结合 ;在结合缓冲液中 ,ASON与目标片段的结合最佳比例是 2 5～ 5 0∶1,TFO与目标片段的结合最佳比例是 60 0∶1;在最适加入剂量比例下 ,结合反应 60min即有大量TFO的复合物形成 ,复合物产量随作用时间延长而增加 ,180～ 2 40min时结合产物完全稳定形成。但ASON的结合复合物大量形成需要 180～ 2 40min。结论 本试验所设计的ASON和TFO能与HAV和DHBV的目标基因序列发生特异的结合 。

反基因及反义寡核苷酸体外抗前列腺癌作用的研究

目的探讨三螺旋形成寡核苷酸(TFO)和反义寡核苷酸(ASO)对前列腺癌细胞雄激素受体(AR)表达和细胞增殖的影响。方法设计并合成针对AR基因的TFO和ASO,经脂质体介导转染前列腺癌细胞株LNCaP。MTT法检测细胞增殖活性,RTPCR检测AR基因表达,免疫组化法检测AR蛋白表达,放射免疫分析检测PSA表达。结果转染后24、48、72h,TFO组LNCaP细胞ARmRNA平均表达水平分别为0.25、0.33、0.46,显著低于ASO组的0.44、0.54、0.60,P<0.05;TFO对LNCaP细胞的生长抑制率(51.8%、65.8%、36.2%)显著高于ASO(28.8%、42.6%、17.5%),P<0.05。TFO对AR蛋白表达的抑制作用强于ASO。转染后24hPSA表达水平[(0.5±0.1)ng/ml]显著低于ASO组[(0.8±0.2)ng/ml],P<0.05。结论在LNCaP细胞TFO对AR表达和癌细胞增殖的抑制作用明显强于ASO,反基因策略对于前列腺癌的治疗具有重要研究价值。