布鲁菌omp19原核表达和间接酶联免疫吸附试验检测布鲁菌方法的建立

本研究原核表达并纯化了布鲁菌脂蛋白Omp19,并通过蛋白免疫印迹法对其免疫原性进行验证。采用Omp19作为包被抗原,建立检测羊种布鲁菌的间接酶联免疫吸附试验(iELISA),检测90份羊血清样本,并与标准血清凝集试验(SAT)比较,用SPSS软件进行数据分析。结果显示,iELISA与SAT的阳性符合率为95.12%,阴性符合率为67.35%,Kappa值为0.607 7。对2种方法进行McNemar卡方检验,结果有显著性差异(P<0.05)。本研究建立的iELISA与SAT的总符合率达80%,可作为羊种布鲁菌病血清学诊断的备用方法。

羊布鲁杆菌脂蛋白OMP19单克隆抗体制备与鉴定

目的制备与鉴定羊布鲁杆菌脂蛋白OMP19单克隆抗体,用于布菌感染免疫机制研究。方法将OMP19基因连接入pET-30a(+)表达载体中,构建pET-30a(+)/OMP19质粒,转化入大肠埃希氏菌BL21(E3),以不同浓度异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,采用镍金属螯合亲和层析(NI-NTA)纯化;以布菌阳性血清检测重组蛋白免疫反应性,并利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,以天然OMP19蛋白及布菌外膜蛋白提取物(NMP)对制备的单克隆抗体进行Western Blot及酶免疫染色试验(IEST)鉴定。结果表达了OMP19蛋白,分子量约19kDa,通过纯化纯度可达95%,Western Blot分析显示蛋白具有良好的抗原性,并制备了OMP19抗原23株鼠源性单克隆抗体,鉴定结果显示22(95.65%)株能与天然OMP19蛋白反应,18(78.26%)株能与NMP反应,其中IgG1(k)亚型占91.30%;4株能与羊种布鲁氏菌菌涂片反应。结论成功制备具有良好抗原性的重组OMP19蛋白,筛选出识别天然蛋白的单克隆抗体,已初步应用于布菌的检测,为OMP19抗原B细胞表位的筛选奠定基础。

羊布鲁杆菌外膜蛋白19(OMP19)的表达及鉴定

目的构建可表达羊布鲁杆菌外膜蛋白19(OMP19)的真核表达载体,研究OMP19对宿主细胞凋亡的作用。方法以羊布鲁杆菌M5-90疫苗株基因组为模板,PCR扩增脂化型外膜蛋白19(L-OMP19)与非脂化型外膜蛋白19(U-OMP19)基因,产物连接至p Zero Back/blunt载体;经双酶切鉴定、测序正确的基因亚克隆到用于包装慢病毒的表达载体p HAGE-CMV-MCS-IZsGreen上,双酶切鉴定,构建含正确L-OMP19、U-OMP19基因的真核表达载体p HAGE-L-OMP19与p HAGE-U-OMP19。分别将构建好的载体转染293FT细胞、Huh7.5.1细胞和JEG-3细胞,用Western blot法及免疫荧光技术检测L-OMP19、U-OMP19蛋白的表达,用藻红蛋白标记的膜联素Ⅴ/7-氨基放线菌素D(annexinⅤ-PE/7-AAD)双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果构建能在细胞内表达L-OMP19和U-OMP19基因的真核表达载体p HAGE-L-OMP19和p HAGE-U-OMP19,二者转染细胞后表达的L-OMP19和U-OMP19蛋白可与特异性抗体反应;L-OMP19和U-OMP19不引起Huh7.5.1细胞凋亡,但可引起JEG-3细胞的大量坏死。结论成功构建可用于慢病毒包装的L-OMP19和U-OMP19真核表达载体,胞内重组表达的脂蛋白OMP19具有良好的抗原性,为研究布鲁杆菌脂蛋白在宿主细胞内作用机制提供实验材料。

羊布鲁菌陕西分离株OMP19基因的克隆、序列分析及原核表达

对羊布鲁菌(Brucella)陕西分离株OMP19基因进行克隆、序列分析及原核表达。利用GenBank中收录的布鲁菌(KT229642.1)OMP19基因序列,设计合成引物,应用PCR技术扩增OMP19基因,并将OMP19基因连接到原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET28a-OMP19,转化到BL21感受态细胞进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot法分析。结果克隆了羊布鲁菌陕西分离株OMP19全基因序列,核苷酸序列分析表明,陕西分离株OMP19基因与国内外已报道的羊布鲁菌核苷酸同源性超过98%,氨基酸同源性超过98%。OMP19重组菌经诱导表达约为19ku的重组蛋白,该蛋白能与本实验室鉴定保存的阳性血清特异性结合,反应原性良好。为羊布鲁菌陕西分离株分子生物学特性研究提供资料,为进一步进行基因工程疫苗研制及ELISA试剂盒抗体检测提供了基础。

布鲁氏菌Omp19基因的生物信息学分析、克隆表达和ELISA方法的初步建立

为了进一步研究布鲁氏菌外膜蛋白19(outer membrane protein 19,OMP19)的结构与功能,并获得具有反应原性的OMP19重组蛋白,建立布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法,试验通过生物信息学软件对OMP19蛋白进行氨基酸序列分析,经PCR技术克隆Omp19基因,利用无缝克隆技术构建重组表达载体pET-32a-Omp19,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导其表达并纯化,并通过Western blotting和ELISA分析方法分别检测OMP19蛋白的反应原性,以建立基于该蛋白的间接ELISA方法。结果显示,OMP19蛋白N端有19个信号肽序列,二级结构以无规则卷曲为主,且OMP19蛋白含有优势抗原表位,利用PCR技术和无缝克隆技术成功构建了Omp19基因的原核表达载体pET-32a-Omp19,成功诱导表达并纯化了OMP19融合蛋白,大小约为35 ku,与理论值相符,并通过Western blotting和ELISA方法鉴定OMP19的反应原性,结果表明该蛋白具有较好的反应原性,且包被浓度为10μg/mL,一抗稀释比为1∶50,二抗稀释比为1∶8000时,P/N值最大,为2.80。本研究结果为布鲁氏菌病快速诊断方法的建立和新型疫苗的研发奠定了理论基础。

布鲁菌外膜蛋白Omp19突变体的构建及免疫原性研究

目的:构建Omp19突变体,分析突变体与Omp19在理化性质和免疫原性上的异同,初步探究Omp19序列3个半胱氨酸残基(Cys)对原蛋白的影响,为以Omp19为组分的布鲁菌亚单位疫苗研究提供依据。方法:以前期构建的含有Omp19核酸序列的质粒为模板,分别缺失或替换序列中编码Cys的碱基,并连接至原核表达载体pET32a,IPTG诱导表达并利用SPXL柱进行纯化,SDS-PAGE鉴定纯化的蛋白。利用质谱、圆二色光谱等对突变体M1、M4开展理化性质分析。ELISA法检测M1、M4免疫小鼠后产生的Omp19特异性抗体和细胞因子水平,用布鲁菌A19株攻击免疫小鼠评价免疫保护效果。结果:获得了无多余条带无多聚体的M1、M4重组蛋白。Omp19、M1、M4相对分子质量测定结果分别为31550、15804、15757,提示Omp19以二聚体形式存在;N端前6个氨基酸残基序列与理论序列一致。Omp19在1、86和106位检测到二硫键;M1在86、106位检测到二硫键;M4分子中检测不到二硫键的存在。圆二色谱结果显示Cys缺失或替换未对Omp19的二级结构造成影响。免疫实验显示,M1、M4激发的Omp19特异的抗体水平、细胞因子水平及对小鼠的保护效果与Omp19无显著性差异。结论:Cys会影响Omp19重组蛋白的制备和质控,其缺失或替换对Omp19原有的理化性质和免疫原性影响不大,突变体蛋白M1、M4作为布鲁菌亚单位疫苗的候选抗原值得进一步研究。

布鲁菌104M∶Omp19过表达株的构建与免疫保护性评价

目的:利用表达载体p NSGro E2His构建104M∶Omp19过表达株,以增强现有布鲁菌疫苗104M株免疫保护效果。方法:以布鲁菌疫苗104M株基因组为模板,通过PCR扩增得到Omp19基因;将经过Bam HⅠ和XbaⅠ双酶切的Omp19基因连接到经同样双酶切处理的p NSGro E2His载体上,构建Omp19-p NSGro E2His过表达质粒;将构建的过表达质粒转化布鲁菌104M株感受态细胞,利用氯霉素抗性筛选构建成功的104M∶Omp19过表达株;通过皮下免疫BALB/c小鼠,从激发的抗体水平、细胞因子水平以及对抗布鲁菌A19株攻毒后的保护作用等方面评价104M∶Omp19过表达株的免疫保护效力。结果:PCR及Western印迹验证表明获得了104M∶Omp19过表达突变株;免疫评价实验显示104M∶Omp19在抗体水平、细胞因子水平与攻毒保护性方面均优于104M,低剂量免疫即可达到较好的保护效果。结论:布鲁菌疫苗104M株过表达Omp19抗原后,免疫保护效果显著增强,可作为一种新的布鲁菌疫苗候选菌株进行后续研究。

重组布鲁菌外膜蛋白Omp19的制备方法及免疫原性研究

[目的]探索重组布鲁菌Omp19蛋白的制备方法,评价其在实验动物中的免疫原性,为中试工艺放大奠定基础。[方法]利用摇瓶培养对重组Omp19蛋白进行原核诱导表达,对培养基类型、诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间、诱导时的菌体密度等条件进行筛选;利用阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析对重组Omp19蛋白进行纯化制备;利用SDS-PAGE和分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)对重组Omp19蛋白的纯度进行鉴定;利用动物实验评价制备的重组Omp19蛋白的免疫原性。[结果]摇瓶培养试验表明,重组布鲁菌Omp19蛋白较优的表达条件为:使用LB培养基,在菌密度OD600 nm值为0.6~1.0时加入0.5 mmol/L的IPTG,于28℃诱导5 h;经3步纯化后,获得了高纯度的重组Omp19蛋白;免疫原性研究表明,经方法优化后制备的重组Omp19蛋白联合佐剂可以较好地刺激BALB/c小鼠产生特异性抗体。[结论]优化了重组布鲁菌外膜蛋白Omp19的制备方法,评价了其在小鼠中的免疫原性,为重组布鲁菌疫苗的研发提供了实验基础。

布鲁氏菌Omp19基因真核载体的构建及对细胞免疫的影响

目的了解羊种布鲁氏菌Omp19基因在真核细胞中的表达和对细胞免疫的影响。方法根据GenBank公布的羊布鲁氏菌16M株外膜蛋白Omp19基因序列设计1对引物,以其全基因组为模板进行扩增,Omp19基因扩增片段连接pMD18-T载体,转染及测序鉴定正确后进行双酶切,构建重组质粒pLEX-MSC-Omp19,转染巨噬细胞RAW264.7中,用Western blot分析Omp19基因在巨噬细胞内的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染Omp19基因的细胞干扰素-γ(IFN-γ)和IL-6分泌的影响。结果获得534bp目的基因片段并成功构建Omp19真核表达载体,Omp19基因在巨噬细胞内成功表达,表达蛋白Omp19可显著提高细胞分泌IFN-γ和IL-6水平(P<0.01)。结论 Omp19基因表达产物在细胞内具有免疫原性,能提高细胞免疫水平,可作为亚单位疫苗候选基因。

布鲁氏菌外膜蛋白基因omp19序列克隆与原核表达

目的:研究猪型布鲁氏菌外膜蛋白基因omp19的序列性质,同时,进行目的基因的原核表达。方法:以猪型布鲁氏菌基因组作为模板进行基因序列的扩增,利用大肠杆菌原核表达系统进行重组表达。结果:猪型布鲁氏菌外膜蛋白基因omp19的开放阅读框序列全长为534 bp,演绎177个氨基酸。诱导表达的重组蛋白质的理论分子量为17.6 kD,而且实际大小与理论值一致。结论:成功表达了Omp19分子,为进一步研究Omp19分子的免疫保护作用奠定了基础。