应用荧光显微镜技术筛选高表达布鲁杆菌Omp31蛋白单克隆抗体的研究

为了制备布鲁杆菌外膜蛋白Omp31的单克隆抗体,试验采用荧光显微镜和ELISA相结合的方法筛选单克隆抗体。结果表明:试验成功筛选出3株外膜蛋白Omp31单克隆抗体,经Westernblot分析这3株单克隆抗体均可与Omp31蛋白发生免疫反应。说明应用荧光显微镜技术可以筛选出效价较高的单克隆抗体。

布鲁菌外膜蛋白Omp31原核表达及抗原性分析

克隆羊布鲁菌的外膜蛋白Omp31基因,在大肠埃希菌中表达、纯化,并对Omp31蛋白的抗原性进行分析。以羊布鲁菌的染色体DNA为模板,扩增Omp31基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠埃希菌ER2566(DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blot鉴定Omp31蛋白的抗原性。将Omp31克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。将重组质粒转化于大肠埃希菌ER2566(DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 ku的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有与布鲁菌外膜蛋白相同的抗原性。

布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因克隆及番茄转化

作为发展可食性疫苗的第一步,将猪源布鲁氏菌蛋白OMP31的编码基因转入番茄,获得了转基因番茄。利用不依赖于连接反应的克隆方法(ligation-independent cloning,LIC)构建了pJG045-Omp31植物表达载体,将此表达载体通过三亲融合法转入农杆菌AGL-0中,用农杆菌介导的植物叶盘转化法转化番茄,并通过对再生植株的基因组中OMP31的编码基因扩增测序,最终筛选出5株转基因番茄。

布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因的克隆、表达和免疫学特性的初步研究

目的研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP31的克隆、测序和表达,并对其进行初步的血清学鉴定。方法从布鲁氏菌基因组中获得OMP31基因连接入PMD-18T克隆质粒并测序,克隆入融合表达载体PGEX-4T-1,构建重组质粒PGEX-4T-1/OMP31,在大肠杆菌中将该蛋白表达。用Western-blot分析重组表达的GST-OMP31的免疫学特性。结果成功构建了PGEX-4T-1/OMP31原核表达载体并在大肠杆菌中表达了OMP31基因,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。结论成功表达了布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因,它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的基础。

利用重组外膜蛋白OMP31检测牛布氏杆菌血清抗体OMP31-ELISA方法的建立

为了研究牛布氏杆菌血清抗体快速诊断方法,试验采用PCR技术从河北省某牛场流产污物中扩增得到牛布氏杆菌外膜蛋白OMP31基因,将该基因插入原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌DE3进行诱导表达,再将表达产物重组外膜蛋白OMP31纯化后作为抗原,建立检测牛布氏杆菌血清抗体的OMP31-ELISA,并对最适反应条件进行确定,然后对从河北省部分牛场采集的150份腹泻奶牛血样进行血清抗体检测。结果表明:牛布氏杆菌OMP31蛋白成功表达,表达产物能与牛布氏杆菌免疫兔血清反应;建立的OMP31-ELISA最佳工作条件为外膜蛋白OMP31抗原的最适包被浓度2.0μg/mL,酶标抗体的工作浓度1∶400,血清稀释度1∶160,以3%明胶-PBS封闭30 min。检测的150份临床血清样本中,特异性、敏感性和符合率分别为90.91%(50/55)、95.79%(91/95)、94.00%(141/150)。说明本方法特异性强、敏感性高,快速,使用方便。

羊布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的基因克隆、原核表达及其对小胶质细胞凋亡的影响

目的本研究旨在构建布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的原核重组质粒pET-30a-omp31,表达并纯化Omp31融合蛋白,初步探讨布鲁氏菌外膜蛋白Omp31对小胶质细胞凋亡的影响。方法对羊种布鲁氏菌Omp31基因进行PCR扩增,并将其定向克隆到原核表达载体pET-30a上,构建原核表达重组质粒pET-30a-omp31,表达、纯化布鲁氏菌Omp31融合蛋白,并用Omp31融合蛋白刺激小鼠小胶质细胞株BV2,利用流式细胞术分析其对小胶质细胞凋亡的影响。结果经过双酶切及测序验证证明成功构建了Omp31基因的原核表达载体pET-30a-omp31,将其进行蛋白的诱导表达、纯化,得到了较纯的Omp31融合蛋白,其融合蛋白的分子量为31kDa左右。将Omp31蛋白刺激小鼠小胶质细胞,发现不同浓度Omp31蛋白刺激组的细胞凋亡率均低于空白对照组(P<0.05)。结论通过基因克隆技术成功构建了Omp31基因的原核表达载体pET-30a-omp31,并对其进行蛋白诱导表达、纯化、复性后得到了Omp31融合蛋白,Omp31融合蛋白能够抑制小胶质细胞的凋亡。

羊布鲁氏菌BCSP31、OMP31、L7/L12基因的原核表达载体构建及表达

目的构建羊布鲁氏菌外膜蛋白BCSP31、OMP31和L7/L12基因的重组表达质粒,并在原核系统中表达。方法根据羊布鲁氏菌M5株外膜蛋白BCSP31、OMP31和抗原L7/L12蛋白基因序列设计引物,分别扩增出大小约为1kb、730bp和380bp的目的基因片断,插入pGEM7Zf(+)中测序并进行分析。将3种基因片段亚克隆入pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western-blot进行分析鉴定。结果SDS-PAGE结果表明3个目的蛋白均以融合蛋白的方式成功表达,在相对分子量57kDa、49kDa、38kDa处有表达条带,经薄层扫描分析,目的蛋白分别占全菌蛋白的42%、36%、40%。Western-blot证实3种融合蛋白均能被布鲁氏菌免疫兔血清识别。结论成功构建了3种蛋白的表达载体并进行了高效表达,3种蛋白均具有良好的免疫原性。

羊布鲁氏杆菌OMP31的真核表达及其应用分析

为了获得可在细胞内表达布鲁氏杆菌外膜蛋白31(OMP31)基因的表达载体和慢病毒,试验从羊布鲁氏杆菌M5-90疫苗株PCR获得OMP31基因,连接至p Zero Back/blunt载体,经双酶切鉴定、测序鉴定正确的基因亚克隆到p HAGE-CMV-MCS-IZs Green表达载体上,双酶切鉴定,构建含正确OMP31基因的表达载体p HAGE-OMP31,与包装质粒ps PAX2和包膜质粒p MD2.G共转染293FT细胞进行慢病毒Lentivirus-OMP31包装;获得的Lentivirus-OMP31感染293FT细胞,利用蛋白质印迹(Western-blot)和免疫荧光(IFS)鉴定OMP31蛋白的表达及其免疫原性;LentivirusOMP31体外感染布鲁氏杆菌的宿主细胞模型单核细胞THP-1和人绒毛膜滋养层细胞JEG-3,Western-blot和IFS鉴定OMP31基因的表达,并利用流式细胞(FCM)检测细胞凋亡情况。结果表明:构建了能够在细胞内表达OMP31基因的真核表达载体p HAGE-OMP31和慢病毒LentivirusOMP31,二者感染细胞后表达的OMP31蛋白可与特异性抗体反应,具有良好的抗原性。经初步鉴定,OMP31蛋白在JEG-3细胞内表达能引起细胞凋亡。说明载体p HAGE-OMP31和慢病毒Lentivirus-OMP31可作为用于研究OMP31与布鲁氏杆菌感染相关性的试验材料。

家畜布鲁氏菌外膜蛋白OMP31的原核表达及其应用

利用PCR技术从布鲁氏菌S2疫苗株中扩增获得外膜蛋白(OMP)31基因,构建了原核表达质粒p GEX-6P-1-OMP31,并转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达,应用Western blot方法鉴定表达产物,并以纯化的OMP31重组蛋白为诊断用抗原,通过反应条件优化,初步建立布鲁氏菌抗体ELISA检测方法。以羊布鲁氏菌病普查检测血清120份为样本,与试管凝集试验进行比较分析。结果:成功构建了p GEX-6P-1-OMP31原核表达载体,并在BL21中得以诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组蛋白分子质量约为52 ku,优化试验确定抗原的最佳包被浓度为3μg/m L,血清最佳稀释度为1∶20。试管凝集试验血清样本的阳性率为83%,采用OMP31作为包被抗原的阳性检出率为79%,二者的符合率为95%。研究表明,OMP31作为间接ELISA包被抗原用于羊布鲁氏菌病血清学检测具有良好的反应性和特异性。

布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的生物信息学预测

目的采用生物信息学方法预测和分析布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的理化性质、信号肽、蛋白结构和抗原表位,为布鲁斯病基因疫苗的研制提供理论基础。方法从GenBank中获取Omp31的氨基酸序列,运用在线软件Protparam分析Omp31的理化性质;采用SOPMA软件预测和分析布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的二级结构。结果利用在线软件预测布鲁氏菌外膜蛋白Omp31分子式为C1135H1725N297O354S4,脂溶性指数为87.31,蛋白质的疏水值为63.26,理论pI值为8.61,原子总数为47900;其氨基酸序列Gly(G)占12.9%,Ala(A)占11.7%。正电荷残基(Arg+Lys)、负电荷残基(Asp+Glu)总数分别为19和24,其不稳定系数48.25。该蛋白为稳定蛋白,亲水性系数GRAVY为-0.091。Omp31无跨膜区域,属于水溶性蛋白,其中无规则卷曲较多,位于蛋白表面。蛋白质中大部分氨基酸可以形成一定的结构域,抗原性总预测值为0.6324。结论生物信息学分析鲁氏菌外膜蛋白Omp31含有多个抗原表位,可能具有免疫原性,表明该蛋白可作为潜在抗原用于疫苗的研制。

牛型布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因的克隆与原核表达

采用PCR技术从河北省某牛场流产污物中扩增得到布鲁氏菌外膜蛋白(OMP31)基因,将其连接入pMD18-T克隆质粒并进行序列测定;测序正确后,将该基因插入pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,转化大肠杆菌Rossetta(DE3)感受态细胞,诱导表达融合蛋白,并用Western-blot分析表达蛋白的免疫反应特性。结果显示,扩增了OMP31的全基因,基因全长723bp,共编码241个氨基酸。成功构建了布鲁氏菌OMP31基因的原核表达载体pET-OMP31,并且在大肠杆菌中表达了OMP31蛋白,经Western-blot鉴定,该蛋白可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应。证实布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因已成功表达,为布鲁氏菌病血清学诊断方法的建立及亚单位疫苗的研究提供了基础资料。