鼻咽癌单克隆细胞体内演进中自发性转移及c－myc、c－fos、bcl－2癌基因蛋白的表达

将鼻咽癌单克隆细胞株ＣＮＥ－２Ｚ－Ｈ５移植于裸鼠，待移植瘤发生转移后，取其淋巴结和肺转移灶癌组织移植裸鼠，如此重复２～４个循环后，观察每代移植瘤的转移表型及肿瘤细胞ｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｆｏｓ、ｂｃｌ－２癌基因蛋白的表达。结果表明：随着肿瘤细胞的演进，每代移植瘤的转移率增高，且转移途径更为单一；肿瘤细胞ｃ－ｍｙｃ、ｂｃｌ－２癌基因蛋白的表达增强；ｃ－ｆｏｓ癌基因蛋白的表达降低。提示：肿瘤细胞的演进、转移及癌基因蛋白的表达存在一定的关系。

急性应激大鼠的心血管反应与脑内c-fos蛋白表达

目的 观察急性躯体 心理应激对大鼠心血管活动的影响及心血管相关脑区c fos蛋白的表达。 方法 采用足底电击结合噪声的应激模型,检测应激后SD大鼠血压、心率和脑内c fos蛋白表达等变化。 结果 (1)应激即刻引起血压和心率明显增加。收缩压从应激前(10 4 .8±9.4 )mmHg升至(132 .3±10 .7)mmHg ,明显高于对照组[(112 .0±8.0 )mmHg ,(P <0 .0 1) ];应激大鼠心率明显高于应激前和对照组(P <0 .0 1)。应激停止后2～3h ,血压和心率恢复到对照水平。(2 )应激组大鼠杏仁核群c fos蛋白阳性细胞为(2 5 .4±3.8) % ,明显高于对照组[(3.4 1±0 .5 ) % ,(P <0 .0 1) ]。下丘脑室旁核c fos蛋白阳性细胞为(2 1.9±2 .0 ) % ,与对照组(7.1±0 .8) %比较,差异有显著性(P <0 .0 5 ,n =8)。额颞叶皮层c fos蛋白阳性细胞为(5 7.5±3.9) % ,显著高于对照组[(16 .4±2 .5 ) % ,(P <0 .0 1,n =8) ]。 结论 急性躯体 心理应激引起的快速心血管反应可能与下丘脑室旁核、杏仁核群神经元激活有关。

树突状细胞瘤内注射联合放疗对小鼠肾癌组织Bcl-2和Bax表达的影响

目的：研究放疗增强树突状细胞免疫治疗小鼠肾癌的作用与机制.方法： 应用Renca肾癌细胞制作BALB/c小鼠皮下移植瘤模型,分为对照组、单纯放疗组、单纯DC组和DC联合放疗组共4组进行治疗.皮下荷瘤的 BALB/c小鼠,在接种瘤细胞后第12～16天,连续5 d接受肿瘤局部放射治疗,7 Gy 6 MeV/次,并于第11、15、19和22天分别4次在肿瘤部位直接注射未负载肿瘤抗原的DC细胞,1×10^6/次,第28天处死小鼠.检测各组肿瘤生长速度和质量.利用免疫印迹法（Western blot法）检测肿瘤组织的相关凋亡蛋白表达.结果：接受不同治疗的小鼠体内肿瘤质量明显不同,未治疗组为（5.3±0.8） g, 单纯DC组（4.5±0.7） g,单纯放疗组（2.8±0.3） g, DC联合放疗组（1.1±0.7） g, 经Wilcoxon-Mann-Whitney秩和检验,DC联合放疗组与单纯治疗组和对照组之间差异均有统计学意义,P＜0.01.DC联合放疗组肿瘤组织中抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,促凋亡蛋白Bax表达上调.结论：瘤内注射DC联合放疗比单一方法明显提高抑制Renca肾癌细胞在BALB/c小鼠的生长,其增效作用涉及肿瘤细胞的凋亡机制.

新仙灵骨葆胶囊调控成骨细胞G1期调节蛋白抗骨质疏松的实验研究

目的：观察新仙灵骨葆胶囊调控成骨细胞G1期调节蛋白抗去卵巢大鼠骨质疏松的作用。方法：去卵巢制备大鼠骨质疏松模型,大鼠随机分为假手术组,模型组,仙灵骨葆胶囊组（350 mg/kg）,新仙灵骨葆胶囊低、中、高剂量组（53、105、210 mg/kg）,各组灌胃相应药物10 m L/kg,连续12周。末次给药后进行骨密度仪分析大鼠的椎骨、股骨、胫骨的骨密度;检测股骨生物力学性能;计算子宫指数;取第3腰椎,免疫组织化学方法检测成骨细胞中细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖激酶（CDK4）、癌基因蛋白p21的表达。结果：与模型组比较,新仙灵骨葆胶囊可显著抑制大鼠体质量,增加子宫指数和椎骨、股骨、胫骨的骨密度,改善大鼠的生物力学性能,降低第3腰椎成骨细胞Cyclin D1、CDK4、p21蛋白水平。结论：新仙灵骨葆胶囊对去卵巢大鼠所致的骨质疏松症有良好的治疗效果,其作用机制可能是通过调控成骨细胞G1期调节蛋白而影响成骨细胞增值。

骨髓增生异常综合征(MDS)基因诊断研究

目的根据Southern印迹杂交结果设计并合成适当引物。方法以32例MDS、13例可疑MDS、53例其他血液病和8例正常人骨髓细胞DNA为模板进行PCR。根据PCR结果和用于上述Southern印迹杂交的限制性酶切位点,设计并合成2个寡核苷酸(Oligos)经地高辛标记,对33例MDS(包括转白血病者),3例可疑MDS和19例其他血液病患者骨髓细胞涂片作原位杂交(ISH)。结果 MDS有共同的PCR产物电池带型。MDS原位杂交均呈阳性反应。对照组19例中仅有1例AA阳性反应,可疑MDS 3例中有2例阳性反应,且杂交信号的增强与MDS转白血病相关(P<0.01),也与SCD阴性相关(P<0.01)。结论建立起MDS PCR基因诊断法,笔者设计的两条Oligos所包含的限制性酶切位点的确是MDS C-erbB重排位置和重排/扩增位置,为MDS基因治疗提供了靶基因的靶位置。

浅谈白血病从简单到复杂的认识过程

本文作者回顾自己40多年来从事白血病发病原理研究,特别是家族性白血病和骨髓增生异常综合征(MDS)研究历程,从实践认识论角度。阐述白血病从简单到复杂的发病过程,即从最初由内源性V-erbB突变所致单基因遗传病,到双基因干细胞病,再到多基因病的认识过程。从而为白血病和肿瘤的基因治疗和预防,以及白血病复发和肿瘤转移研究和预防提供理论依据。

抑制GATA5蛋白可否促进HELA细胞中癌干细胞因子sox2、c-myc及CD44的表达

背景:GATA5蛋白在多种癌症发生过程中被抑制表达,有研究显示GATA5降低表达或被甲基化后失去功能,不能有效促进干细胞分化,维持细胞的正常功能。宫颈癌HELA细胞表达GATA5蛋白,在宫颈癌中抑制GATA5表达是否可促进其恶性转化还是未知。目的:分析GATA5蛋白在宫颈癌HELA细胞中被进一步抑制表达后,其恶性转化情况及与癌干细胞形成相关因子sox2,c-myc及CD44的表达情况。方法:转入CMV-siRNA-gata5,使GATA5在HELA细胞中被进一步抑制表达后,(1)RT-PCR检测c-myc mRNA,sox2 mRNA的表达;(2)MTT法检测HELA细胞的增殖能力;(3)检测HELA细胞的集落形成和软琼脂单克隆形成能力;(4)Western blot检测细胞GATA5、c-myc、sox2蛋白表达变化;(5)激光共聚焦检测细胞的CD44蛋白定位及蛋白表达变化。结果与结论:用CMV-siRNA-gata5抑制HELA细胞中的GATA5表达后,HELA细胞的增殖能力、单克隆形成及集落形成能力均增强;同时发现其癌干细胞因子c-myc,sox2,CD44的表达增强。提示GATA5蛋白被抑制表达后,HELA细胞的恶行性为增加,其机制可能是GATA5被抑制后,促进了癌干细胞因子sox2,c-myc,CD44等的表达。

miR-21调控PTEN/AKT通路影响LPS诱导下足细胞中MMP-2和MMP-9表达

目的研究microRNA-21(miRNA-21,miR-21)在同源性磷酸酶张力蛋白(PTEN)及磷酸化蛋白激酶B(pAKT)信号通路中对脂多糖(LPS)刺激下足细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达的影响及调控机制。方法取传3~8代足细胞,分为LPS组和对照组,LPS组给予10 mg/L LPS,对照组给予相同剂量磷酸盐缓冲液。24 h后采用实时荧光定量PCR法和ELISA法分别检测miR-21、MMP-2及MMP-9的表达,并分析miR-21和MMP-2、MMP-9的相关性。构建外源性miR-21干扰的LPS刺激下足细胞损伤模型,采用Western blot检测外源性miR-21对MMP-2、MMP-9、PTEN和p-AKT表达的影响。结果与对照组比较,miR-21与MMP-2、MMP-9在LPS刺激下足细胞中表达升高,两者呈正相关(P<0.05)。外源性上调miR-21表达,MMP-2、MMP-9和p-AKT表达升高,PTEN表达降低(P<0.05);而外源性抑制miR-21表达,MMP-2、MMP-9和p-AKT表达降低,PTEN表达升高(P<0.05)。结论 miR-21可通过调控PTEN/AKT通路促进LPS刺激下足细胞MMP-2和MMP-9表达。

晚期癌症的治疗策略:从靶向治疗到基因治疗

本文作者基于对白血病等恶性肿瘤发病原理和病因的系统认识和国外最新成果,在对早中期癌症基因治疗成功的基础上,提出晚期癌症的治疗策略,即从癌蛋白和癌基因两个层面上采用两种方案即:①靶向三个癌基因(V-erbB,TS和C-Met),它们分别是癌症致病基因,癌变基因和晚期癌基因)产物的小分子抑制剂和5-氟脲嘧啶核苷(5-Fu);②反基因V-erbB+CpG双寡核苷酸组合方案,相结合。首先采用:①方案消灭大量癌细胞,再用②方案,针对癌干细胞和残余癌细胞进行综合治疗。继续使用第二方案,直到完全缓解5年以上。上述治疗可称为基因产物治疗和基因治疗。希望医者在实践中加以优化和完善。

内源性逆病毒癌基因V-erbB突变与白血病发生

目的 :证明鸡原始红细胞增多症逆病毒癌基因 V - erb B在人类白血病和骨髓增生异常综合征 (MDS)患者基因组内的存在。方法 :应用 V- erb B PCR,V - erb B寡核苷酸 (Oligo)原位杂交技术和 PCR产物 DNA测序 ,对 84例 MDS、可疑 MDS和 4 9例其他相关血液病进行检测。结果 :2例患者骨髓细胞基因组内均存在 V- erb B亚基因片段 ,同源性占 99.5 % ,它们具有相同的限制性酶切位点 ,因此可以在 Southern印迹杂交条件下发生骨髓细胞 C- erb B重排和重排 /扩增。白前 P1 P2 PCR产物有 4 2 0 bp,P1 P3产物有 6 5 0 bp,而白血病 (AL- M4 ) P1 P2 PCR产物仅 390 bp,P1 P3PCR因 P3无模板序列而无结果。提示从白前发展为白血病 ,可能发生 V- erb B亚基因序列的缺失 ,即缺失突变。结论 :大鼠和人白血病和食管癌等可能均起源于其基因组内存在 V- erb B亚基因及其缺失突变。白血病发病中除了上述病因以外 。

反基因V-erbB寡核苷酸对卵巢癌细胞株SKOV3的影响

目的 探讨反基因V-erbB寡核苷酸(Oligo)对卵巢癌细胞株SKOV3的影响.方法 将体外合成的经硫代磷酸修饰的反基因V-erbB Oligo作用于SKOV3卵巢癌细胞株,采用流式细胞术检测SKOV3细胞表达、增生指数及凋亡率.结果 终浓度为5 mmol/L反基因V-erbB Oligo对卵巢癌细胞具有显著作用(P＜0.01),癌细胞的p185蛋白表达、细胞增生均受到明显抑制(P＜0.01);细胞凋亡也显著增加.而叠加剂量的药物浓度并无叠加效应.结论 反基因V-erbB寡核苷酸能有效地封闭细胞原癌基因C-erbB的表达,但其剂量具有一定的饱和浓度.

骨髓增生异常综合征染色体异常与白血病发展

目的:探讨在骨髓增生异常基础上白血病发展。方法:骨髓细胞Brdu-SCD细胞周期检测法和R-带染色体核型分析法,在1989年—1998年间对361例MDS (按FAB分类) 、11例回顾性诊断白血病前期(PL)和73例MDS-RCMD(按WHO分类)以及140例AA和PNH骨髓细胞进行分析。并对18例MDS-RCMD进行V-erbB基因诊断。还对30例MDS和AA进行动态观察。与此同时,有25例MDS转变为急性白血病,它们几乎都是骨髓细胞SCD阴性患者,与回顾性诊断白前的结果相同。结果:1)361例MDS中MDS-RA占91.3 %,核型异常检出率为66.2 %,SCD阴性病例占50.9 %,与以往报道的结果相似。染色体异常检出率高于文献报道。MDS中两项均不正常的病例占31.5 %。2)AA和PNH核型异常检出率为13.5 %,SCD阴性病例占19.2 %。两项指标均明显低于MDS,且两项均不正常患者仅为1.4 %。3)MDS,RCMD,AA和回顾性白前有相同染色体异常,但有不同的克隆性异常检出率。4)MDS从SCD阳性转变为阴性,AA保持阳性或阴性转变为阳性。结论:1)白前和MDS发展为白血病,或白前转变为MDS而后发展为白血病的共同机制在于骨髓细胞SCD阴性.。它可能与胸苷酸代谢异常和胸苷酸合成酶基因扩增并长期积累有关。2)白前、MDS 和AA 可能有共同的细胞克隆起源。这一点已为AA/AML家系研究所证实。

羟氯喹及没食子酸酯对HaCaT细胞光照射的影响

目的探讨羟氯喹和绿茶活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对中波紫外线(UVB)损伤永生化角质形成细胞株(HaCaT细胞)的保护作用及其机制。方法采用UVB定时及定量照射培养的HaCaT细胞,分别加入羟氯喹和EGCG干预处理,以RT-PCR法检测各受试组p53、p21、c-fos基因表达水平。结果 UVB照射后可明显增加HaCaT细胞中p53,p21,c-fos mRNA表达,羟氯喹和EGCG可不同程度地下调上述基因表达水平。结论羟氯喹和EGCG的光保护作用在HaCaT细胞可能与其抑制p53,p21,c-fos基因表达有关。

弥漫大B细胞淋巴瘤患者蛋白表达检测的预后意义

目的探讨TP53、Bcl-2、Bcl-6、Myc蛋白表达对弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBcL）患者预后的影响。方法回顾性分析223例DLBCL患者的临床资料，对有完整病理资料患者的石蜡标本采用免疫组化法进行TP53、Bcl-2、Bcl-6、Myc蛋白表达检查，并结合临床资料进行预后影响因素分析。结果①223例患者中男133例，女90例，中位发病年龄为56（15～83）岁。所有患者均进行TP53、Myc、Bcl-2、Bcl-6蛋白检测，阳性率分别为39．0％、38．6％、69．1％、56．5％，Myc／Bcl-2双表达22．7％（64／223）；按照Hans分型分类，生发中心起源B细胞亚型（GCB型）占27．4％，non-GCB占72．6％。②进一步分析发现TP53蛋白表达组non—GCB亚型居多（81．6％对66．9％,P=0．021），且与Myc表达存在显著正相关（P〈0．001）。③219例患者获得完整随访资料，中位随访时间为38（2～97）个月，3、5年总生存（OS）率分别为70％、66％。单因素分析结果显示Bcl-6蛋白表达为预后良好因素（P=0．034），TP53高表达（P=0．007）、Myc／Bcl-2双表达（P=0．012）为预后不良因素。多因素分析结果显示TP53高表达（HR=1．848，95％CI 1．025-2．968，P=0．010）及Myc／Bcl-2双表达（HR=1．124，95％C11．134～2．256，P=0．032）为独立预后不良因素。④TP53阳性与阴性组患者3年OS率分别为59％和77％，5年OS率分别为57％和71％，差异均有统计学意义（P值均〈0．05）。结论免疫组化法检测Mye／Bcl-2双表达及TP53高表达能够预测DLBCL患者的预后,Myc／Bcl-2双表达及TP53高表达是DLBCL患者的独立预后不良因素。

微小核糖核酸-148a调控胰腺癌细胞中ErbB3的表达

目的 在胰腺癌细胞中寻找并验证微小核糖核酸（miRNA）-148a的下游调控基因.方法 运用生物信息学方法预测miRNA-148a调控的目的基因,构建含目的基因的3’端非翻译区（3＇-UTR）的荧光素酶报告质粒,用脂质体转染miRNA-148a类似物和抑制剂进入胰腺癌细胞BXPC-3,检测荧光素酶活性,确定miRNA-148a是否直接与靶基因3’-UTR结合.同时改变胰腺癌细胞BXPC-3中miRNA-148a表达水平,用Western免疫印迹法在蛋白水平检测靶基因ErbB3表达的变化.统计学处理采用单因素方差分析.结果 生物信息学发现ErbB3和miRNA-148a上有一个保守的结合靶位点.miRNA-148a直接与ErbB3的3’-UTR结合,使荧光素酶活性下降到阴性对照的[-（25.00±4.70）％,F=4.66,P＜O.01]；过表达miRNA-148a后,BXPC-3细胞中ErbB3蛋白水平灰度值下降到阴性对照的[（26.16±4.69）％,F=6.563,P＜O.05].结论 miRNA-148a在胰腺癌细胞株BXPC-3中直接靶向并调控ErbB3的表达.

肝硬化肝癌与白血病发病原理相关性研究

目的参照白血病发病原理,探讨肝硬化肝癌发病机制。方法对8例肝硬化患者进行骨髓和外周血细胞遗传学研究,对12例肝硬化患者进行血清叶酸和维生素B_(12)水平测定,并对肝硬化肝癌中发现的V-erbB样基因和白血病V-erbB基因进行同源性分析。结果8例患者骨髓细胞染色体核型正常,但25%患者骨髓细胞SCD阴性(即细胞周期成倍延长),且有相同比例的患者骨髓出现超2n细胞。前者与难治性贫血(MDS-RA)相似,后者与ALL染色体异常类型相同。12例外周血细胞染色体检查中7例染色体脆性增加。血清叶酸水平显著下降,而维生素B_(12)则显著增加,与难治性贫血伴原始细胞增多(MDS-RAEB)相似,提示肝细胞的高度增生。肝癌所谓erbB样基因与V-erbB部分相同。结论肝癌和白血病有相似发病机制和相同致病基因,但激活机制不同。

外阴尖锐湿疣组织P53和增殖细胞核抗原的检测

目的 :观察外阴尖锐湿疣组织P5 3蛋白和增殖细胞核抗原的表达。方法 :采用免疫组化染色。结果 :在2 0例尖锐湿疣中P5 3阳性表达为 2例 (2 / 2 0 ) ,正常皮肤无P5 3蛋白表达 ,两者比较差异无显著性 (P >0 0 5 )。增殖细胞核抗原 (PCNA)阳性表达为 18例 (18/ 2 0 ) ,且呈 (卅 )。 10例正常皮肤PCNA阳性表达为 6例 (6 / 10 ) ,呈 (+) ,病变组织PCNA阳性表达比正常组织明显增高 ,差异有极显著性 (P <0 0 1)。结论 :PCNA能有效地反映外阴尖锐湿疣组织细胞增殖活性 ,P5 3突变在该病变组织细胞增殖中并不起主要作用。

信号素3A诱导培养大鼠皮质神经元凋亡与PI3K／Akt通路有关

目的探讨外源性信号素3A（semap3A，Sema3A）对原代培养大鼠皮质神经元凋亡的影响和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide-3-kinase，P13K）／丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（serine／threoninekinase，Akt）通路在Sema3A诱导凋亡中的作用。方法体外培养新生Sprague—Dawley大鼠皮质神经元，并用微管相关蛋白-2免疫荧光染色鉴定。培养大鼠皮质神经元随机分为正常对照组和不同浓度Sema3A（500、1000和2000μ倒）组。CCK8法检测神经元存活率，Hoechst33342染色和TUNEL染色观察神经元凋亡，蛋白质印迹法检测P—Akt、Akt和Bcl-2表达。结果培养的皮质神经元纯度达95％以上。CCK8检测显示，500、1000、2000g／mlSema3A组细胞存活率分别为对照组的（80．9±5．3）％、（67．5±3．9）％和（50．2±4．4）％（F=165．042，P=0．000）。Hoechst33342染色显示，正常对照组及500、1000、2000Sema3A组神经元凋亡率分别为（22．4±1．2）％、（34．0±1．2）％、（39．3±1．4）％和（47．3±2．3）％（F=103．237，P=0．000）。TUNEL染色显示，正常对照组及500、1000、2000Sema3A组神经元凋亡率分别为（23．9±1．1）％、（31．9±1．0）％、（40．14-1．5）％和（51．4±3．4）％（F=103．118，P=0．000）。蛋白质印迹法显示，随着Sema3A浓度的增高，P—Ala（F=15．959，P=0．001）和Bcl-2（F=18．776，P=0．001）表达逐渐下调；而Akt表达无显著改变（F=0．590．P=0．639）。结论Sema3A主要通过诱导神经元凋亡而降低培养皮质神经元存活率，其机制可能与下调P—Akt和Bcl-2表达有关。

单链远侧上游因子结合蛋白1在肝癌发病机制中的作用

单链远侧上游因子结合蛋白1（FUBP1）是新近发现的转录因子，又名FUSE结合蛋白、DNA解螺旋酶V，在体内外均能与单链DNA上的远侧上游元件结合，促进含FUSE的各种基因（尤其是c-myc基因）的转录。