人卵丘颗粒细胞和壁层颗粒细胞体外培养方法比较

目的:建立有效分离、提纯及培养人卵丘颗粒细胞的方法,并与人壁层颗粒细胞的体外培养相比较。方法:收集卵胞浆内单精子显微注射取卵时的卵泡液和直接机械分离卵母细胞所得的卵丘颗粒细胞复合物,直接将卵丘颗粒细胞复合物接种于培养皿中培养。用密度梯度离心法分离卵泡液中的人壁层颗粒细胞。用免疫荧光法检测卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)的表达;用CCK-8法检测细胞生长曲线;用ELISA检测这2种颗粒细胞分泌雌激素的能力。结果:直接法所得人卵丘颗粒细胞培养24 h后可贴壁,体外培养生长状态与人壁层颗粒细胞相似;免疫荧光检测显示两者均表达FSHR;CCK-8实验结果表明,两者体外培养生长曲线相似;ELISA结果显示两者分泌雌激素能力相当。结论:利用机械切割获得人卵子周围卵丘颗粒细胞复合物直接培养的方法操作简单,获得的人卵丘颗粒细胞具有与人壁层颗粒细胞相似的生长状态、生长曲线以及雌激素分泌能力,可作为人颗粒细胞亚群体外培养方法的补充。

卵泡刺激素和卵丘细胞对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的:研究卵泡刺激素和卵丘颗粒细胞对体外培养的卵母细胞核成熟的影响。方法:未成熟卵母细胞来自人绝经期促性腺激素刺激后的小鼠卵巢。所得生殖泡期卵母细胞分成裸卵组和卵丘-卵母细胞复合物组,在分别添加0.1,0.5和1u/mL卵泡刺激素的合成人输卵管液培养液和不添加卵泡刺激素的合成人输卵管液培养液(对照组)中培养36h。培养过程中在倒置显微镜下观察各组卵母细胞生殖泡破裂和第一极体出现。出现第一极体的卵母细胞判为核成熟。结果:裸卵各卵泡刺激素组与对照组的卵母细胞生殖泡破裂发生率及第一极体排出率差别无显著性意义(P>0.05);卵丘-卵母细胞复合物各卵泡刺激素浓度组比对照组卵丘-卵母细胞复合物有更高的卵母细胞生殖泡破裂发生率及第一极体排出率(P<0.05);但各卵泡刺激素浓度组间卵丘-卵母细胞复合物的卵母细胞生殖泡破裂发生率及第一极体排出率差别无显著性意义(P>0.05)。卵丘-卵母细胞复合物各组的卵母细胞生殖泡破裂发生率和第一极体排除率明显高于裸卵各组(P<0.05)。结论:(1)卵丘细胞对卵母细胞的核成熟有重要作用。(2)卵泡刺激素对卵丘-卵母细胞复合物中卵母细胞核成熟有促进作用,其作用可能是通过颗粒细胞介导的。(3)卵泡刺激素对卵母细胞核成熟的促进作用可能主要是促进减数分裂的恢复。

不同组分体外成熟培养基对绵羊卵母细胞成熟、代谢及孤雌胚胎发育的影响

为了探究不同组分体外成熟培养基对绵羊卵母细胞体外成熟的影响,试验从健康绵羊卵巢中分离卵丘-卵母细胞复合体(COCs),将分离的COCs分为V-FSH+LH+E_(2)+FBS组、V-FSH+FBS组、V-FSH+LH+E_(2)+BSA组、P-FSH+LH+E_(2)+FBS组、P-FSH+FBS组、P-FSH+LH+E_(2)+BSA组,每组分别添加以V-促卵泡素(FSH,垂体中提纯的FSH)和P-FSH(体外基因重组表达的FSH)为基础设计的体外成熟培养基以进行体外成熟试验,即各组依次添加V-FSH+促黄体素(LH)+雌激素(E_(2))+胎牛血清(FBS)、V-FSH+FBS、V-FSH+LH+E_(2)+牛血清白蛋白(BSA)、P-FSH+LH+E_(2)+FBS、P-FSH+FBS、P-FSH+LH+E_(2)+BSA体外成熟培养基,体外成熟后检测各组卵丘扩展指数(CEI)、第一极体排出率、卵母细胞氧化还原态、乳酸生成量、葡萄糖消耗量、ATP生成量;统计孤雌胚胎的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数,比较不同组分体外成熟培养基对卵母细胞成熟、代谢及孤雌胚胎发育的影响。结果表明:V-FSH+LH+E_(2)+FBS组CEI最高,除与P-FSH+FBS组差异不显著外(P>0.05),与其他组均差异显著(P<0.05)。V-FSH+LH+E_(2)+FBS组和P-FSH+FBS组卵母细胞的第一极体排出率较其他组高,但各组间均差异不显著(P>0.05)。V-FSH+LH+E_(2)+FBS组、P-FSH+FBS组、P-FSH+LH+E_(2)+BSA组的相对氧化还原比均接近1且差异不显著(P>0.05),但均显著低于其他组(P<0.05)。P-FSH+FBS组的COCs乳酸生成量/COCs葡萄糖消耗量最高,除与V-FSH+LH+E_(2)+FBS组、P-FSH+LH+E_(2)+FBS组差异不显著(P>0.05)外,显著高于其他组(P<0.05)。V-FSH+LH+E_(2)+FBS组与P-FSH+FBS组的COCs ATP生成量差异不显著(P>0.05),但均显著高于其他组(P<0.05)。V-FSH+LH+E_(2)+BSA组、P-FSH+LH+E_(2)+BSA组卵裂率差异不显著(P>0.05),但均显著低于其他组(P<0.05)。V-FSH+LH+E_(2)+FBS组与P-FSH+FBS组囊胚率均显著高于其他组(P>0.05),但各组的囊胚细胞数差异不显著(P>0.05)。说明不同来源的FSH与不同组分协同作用会对绵羊卵母细胞的成熟、代谢及孤雌胚胎发育产生不同的效果,并影响了其后续胚胎的发育能力。