通过荧光标记的凝胶阻滞技术分析Opaque2蛋白与ZmGRAS11启动子的结合位点

凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)是研究蛋白质与核酸结合的一种关键实验技术。EMSA技术兴起以来,使用放射性同位素、生物素标记核酸探针的手段已经非常成熟,但这两种传统的标记技术分别具有放射性探针稳定性差和生物素检测步骤复杂等缺点。近年来,尽管荧光标记探针逐渐被应用于EMSA中,但是对于利用荧光标记探针的EMSA仍缺乏系统的报道。对荧光标记的EMSA技术流程进行了优化和系统总结;利用6-羧基荧光素(6-carboxy-fluoroscine,FAM)标记ZmGRAS11启动子探针,通过EMSA检测其与Opaque2蛋白的结合,明确了蛋白和探针的适宜比例为8∶1。对GCN4 motif序列碱基进行突变并利用EMSA分析Opaque2与ZmGRAS11启动子之间的结合位点,结果表明GCN4 motif的“TGAC”核心基序在ZmGRAS11启动子与Opaque2蛋白的结合中可能起到了关键作用。研究结果为进一步探究Opaque2-ZmGRAS11转录调控模块在玉米籽粒发育中的作用机理提供了数据支撑。