铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH基因扩增、融合、克隆及原核表达

目的 在大肠杆菌中串联表达铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH ,获得重组融合蛋白OprF/H ,为抗铜绿假单胞菌的疫苗研究打下基础。方法 从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA ,设计PCR引物扩增出OprF和OprH基因 ,扩增片段经过酶切、连接和PCR扩增后 ,割胶回收PCR产物并将其克隆至克隆质粒 ,测序后构建表达质粒pGEX F/H ,并转化大肠杆菌BL2 1。结果 重组表达质粒经IPTG诱导后表达融合外膜蛋白OprF/H。

铜绿假单胞菌oprH基因DNA疫苗的构建与检测

研究旨在构建铜绿假单胞菌oprH基因的DNA疫苗。试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌的oprH基因序列,设计合成了一对特异性引物,利用PCR技术由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得该目的基因,进行胶回收纯化并与T载体进行连接,经双酶切和PCR鉴定后将重组质粒进行酶切回收目的基因片段,并将其亚克隆于真核表达载体pCAGGS-HA中,以双酶切和PCR方法进行鉴定。结果显示:PCR成功扩增出约600 bp的oprH基因,连接T载体后的重组质粒经双酶切和PCR鉴定,均可获得大小正确的目的基因片段。真核重组载体鉴定结果显示,oprH基因成功克隆于真核表达载体pCAGGS-HA中。研究表明,试验成功构建了oprH基因的DNA疫苗,为进一步研究其免疫效果及铜绿假单胞菌新型疫苗的研制提供参考。

铜绿假单胞菌重组Bb-OprH疫苗诱导的保护力及其细胞免疫应答

目的探讨铜绿假单胞菌(Pa)重组两歧双歧杆菌(rBb)-OprH疫苗免疫及Pa PAO1株攻击后,诱导的小鼠保护力、脾细胞增殖、亚群及凋亡变化情况。方法将疫苗口服灌胃免疫Balb/c鼠,在首免后4周用5×10~7 CFU的PAO1株滴鼻攻击。攻击后2周杀鼠取脾,计数小鼠肺细胞负荷,MTT检测小鼠脾细胞增殖,流式细胞术检测小鼠脾细胞亚群及脾细胞凋亡率。结果疫苗免疫及PAO1株攻击后,小鼠肺细菌负荷减少,脾细胞增殖、CD4^+T细胞明显增加,而脾细胞凋亡明显减少。结论铜绿假单胞菌重组Bb-OprH疫苗可诱导铜绿假单胞菌感染小鼠产生保护性细胞免疫应答。

铜绿假单胞菌重组Bb-OprH疫苗诱导的保护力及体液免疫应答

目的用重组Bb-OprH疫苗免疫小鼠,观察其对小鼠的保护力及诱导的体液免疫应答情况。 方法将重组疫苗经口灌胃接种BALB/c小鼠,1次/d,每周3d,连续3周。于首次免疫后第4周以5×10^7 CFU的铜绿假单胞菌PAO1株对小鼠滴鼻攻击,1次/d,连续3d,攻击后2周处死小鼠,计数小鼠肺细胞负荷。于免疫前、首次免疫后4周尾静脉采血,于攻击后2周眼球取血,常规ELISA检测血清IgG及其亚类和IgE。 结果疫苗免疫及PAO1株攻击后,小鼠肺细菌负荷减少(F=1 506.793,P<0.05);初免后4周,小鼠血清抗体IgG、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE明显升高(0.078±0.005、0.010±0.002、0.038±0.004、0.029±0.002和0.027±0.003,P<0.05),较空载体组和Bb对照组差异有显著性(P<0.05);攻击后2周,小鼠血清抗体IgG、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE再次升高(0.118±0.010、0.018±0.001、0.068±0.013、0.032±0.003和0.041±0.004,P<0.05),较空载体组和Bb对照组差异有显著性(P<0.05)。 结论铜绿假单胞菌重组Bb-OprH疫苗可诱导铜绿假单胞菌感染小鼠产生保护性体液免疫应答。

铜绿假单胞菌OprH基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprH,研究其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法以铜绿假单胞菌PAO1标准株双链DNA为模板,通过PCR扩增OprH基因。经酶切后与载体pGEX-1λT进行连接,构建重组质粒pGEX-OprH,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 PCR扩增出660 bp的OprH编码基因;重组质粒经双酶切和PCR证实OprH基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE电泳发现表达产物相对分子质量约为47 000 Mr,与前期预测结果一致,大肠埃希菌BL21(DE3)表达蛋白为菌体量的22%;免疫印渍表明Pa抗原免疫的小鼠血清能特异识别47 000 Mr重组蛋白。结论铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprH在E.coli BL21(DE3)中高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。

铜绿假单胞菌外膜蛋白H原核表达、多克隆抗体制备及免疫保护作用

目的为铜绿假单胞菌外膜蛋白H(OprH)工业发酵与疫苗开发研究奠定基础。方法采用分子克隆技术构建OprH蛋白的表达菌株,通过正交试验设计筛选OprH菌株的最佳培养条件与表达条件。利用切胶纯化获得OprH蛋白并免疫小鼠,制备OprH蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体滴度,蛋白质印迹法检测抗血清特异性;对小鼠免疫OprH蛋白,攻毒铜绿假单胞菌,检测蛋白的免疫保护作用。结果 OprH重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果,以及蛋白表达、纯化条带大小与预测一致。OprH菌株最佳培养条件为转速230r/min,葡萄糖浓度0%,装液量50mL;最佳诱导表达条件为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度0.3mmol/L,诱导时菌液D600值0.8,温度32℃,诱导时间3h。ELISA法获得OprH抗血清滴度达1∶1 600,蛋白质印迹法证实抗血清具有很好的特异性。OprH免疫小鼠激活的特异性免疫对小鼠铜绿假单胞菌感染的保护率达到46.15%,与对照相比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建OprH表达载体,纯化获得OprH蛋白,制备OprH蛋白多克隆抗体,实验结果表明OprH蛋白对小鼠铜绿假单胞菌感染具有免疫保护作用,并获得OprH蛋白菌株的最佳培养条件与表达条件。