铜绿假单胞菌oprI基因DNA疫苗及其重组亚单位疫苗免疫效果的评估

为评估铜绿假单胞菌opr I基因DNA疫苗和重组亚单位疫苗对小鼠的免疫效果,本实验将铜绿假单胞菌外膜蛋白编码基因opr I克隆至真核表达载体p CAGGS-HA中构建重组质粒p CAGGS-opr I,经酶切鉴定正确后获得DNA疫苗。同时将opr I基因克隆至原核表达载体p ET32a中构建重组质粒p ET32a-oprI,经酶切鉴定正确后转入大肠杆菌,经IPTG诱导重组Opr I蛋白(rOprI)的表达,采用亲和层析法纯化后以SDS-PAGE检测,结果显示正确表达了r Opr I,且获得了其纯化蛋白,利用其制备重组亚单位疫苗。分别以DNA疫苗和重组亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠,并以铜绿假单胞菌的灭活疫苗和外膜蛋白疫苗为对照,采用间接ELISA法检测免疫后不同时间小鼠血清中的抗体水平和血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的含量;初免42 d后以铜绿假单胞菌(1.25×109 cfu/mL,100μL/只)对各组小鼠进行攻毒试验,通过测定各疫苗对小鼠的保护率,评估疫苗的保护效果。结果显示,各疫苗诱导的免疫小鼠血清抗体水平和细胞因子含量均显著高于阴性对照组(P<0.05),且重组亚单位疫苗诱导小鼠的抗体水平和IL-4含量均显著高于DNA疫苗(P<0.05),而IFN-γ和IL-2含量则与DNA疫苗无显著差异(P>0.05)。小鼠攻毒试验结果显示,DNA疫苗组、重组亚单位疫苗组、外膜蛋白疫苗组和灭活疫苗组小鼠获得的免疫保护率分别为45%、55%、70%和95%。上述结果首次表明以铜绿假单胞菌opr I基因制备的DNA疫苗和r Opr I重组亚单位疫苗均可诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答,并可为小鼠提供对铜绿假单胞菌攻毒的免疫保护效果,但二者的免疫效果还需进一步提高。本研究为铜绿假单胞菌疫苗的研究提供了参考依据。

铜绿假单胞菌重组PcrV-OprI疫苗保护小鼠骨折固定术后感染的作用

目的构建髓内针固定小鼠开放性股骨骨折后铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)感染模型,评价候选PA疫苗重组PcrV-OprI的免疫保护效果。方法采用大肠杆菌表达PcrV-OprI蛋白,依次经亲和、疏水层析纯化得到目的蛋白。C57BL/6J小鼠在第0、14、21天免疫PcrV-OprI蛋白后,使用酶联免疫吸附法检测血清中特异性IgG抗体及亚型效价。末次免疫后14 d,进行髓内针固定小鼠开放性股骨骨折术。术后PAO1菌株感染,通过比较免疫组与对照组细菌定植、体质量、组织病理学和X线影像表现等差异,评价PcrV-OprI抗原保护效果。结果PcrV-OprI免疫组小鼠血清中特异性抗体水平显著升高(P<0.05),且以IgG1亚型为主;PcrV-OprI免疫组体质量减轻幅度显著低于对照组(P<0.05),PcrV-OprI免疫组软组织、骨内、植入物细菌数量显著低于对照组(P<0.05);PcrV-OprI免疫组炎症病理损伤小于对照组;在观察期结束时,PcrV-OprI免疫组骨折线清晰且逐渐闭合,呈愈合趋势而对照组骨折处未见明显愈合。结论PcrV-OprI免疫能有效引起小鼠体液免疫应答,在开放性骨折髓内针固定术后PA感染模型中具有显著保护效果。

铜绿假单胞菌oprI基因的反向斑点杂交检测法

目的建立一种早期快速检测铜绿假单胞菌的方法。方法根据铜绿假单胞菌特异的oprI基因设计引物,聚合酶链反应合成特异探针,光敏生物素标记细菌DNA,应用反向斑点杂交法检测铜绿假单胞菌。结果所合成的探针具有高度特异性,能鉴别铜绿假单胞菌,与其他细菌、病毒、真菌间无交叉反应。该方法能检测出100 ng细菌DNA。结论反向斑点杂交法具有快速、特异的优点,对铜绿假单胞菌的早期检测具有重要意义。

荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌外膜蛋白oprI基因的标准品的构建

目的构建荧光实时定量PCR(FQ-PCR)标准品测定铜绿假单胞菌oprI基因,以此测定铜绿假单胞菌菌量。方法以铜绿假单胞菌的oprI基因为目的基因设计探针引物,提取细菌基因组DNA,与pMD 18-T Vector连接并转化到大肠杆菌中。用氨卞青霉素筛选出白色菌落,提取含目的基因质粒,并用HindⅢ限制酶进行线性化处理,通过直接PCR、OD值测定及DNA片段测序鉴定其特异性。根据OD值确定浓度,制备FQ-PCR梯度浓度参考标准品,做出标准曲线,检测各样品菌菌量。结果铜绿假单胞菌oprI基因的目的片段成功制备,获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性,并获得很好的标准曲线(相关系数0.994),成功检测了铜绿假单胞菌标准菌株、培养株的菌量,而大肠杆菌及阴性对照无扩增。结论成功构建FQ-PCR检测铜绿假单胞菌oprI基因的定量参考标准,荧光实时定量法可以快速检测铜绿假单胞菌。

分子佐剂IL-17与IL-2对铜绿假单胞菌外膜蛋白OprI免疫效果的影响

目的探讨分子佐剂IL-17、IL-2对铜绿假单胞菌(Pa)外膜蛋白OprI免疫效果的影响。方法分别以IL-17、IL-2作为分子佐剂用Pa外膜蛋白OprI于第0、2、4周免疫雌性C57BL/6小鼠,同时设立单独的佐剂与蛋白对照组。末次免疫2周后,ELISA检测各组小鼠血清IgG、IgA以及IgG亚类水平;ELISA法检测小鼠脾细胞上清中Th1/Th17型细胞因子INF-γ、IL-2、IL-17以及Th2型细胞因子IL-4、IL-6水平;MTT法检测IL-17、IL-2分子佐剂对小鼠脾细胞增殖情况的影响,并以ConA作为阳性对照;末次免疫2周后Pa鼻内感染小鼠,感染后10 d计算各组小鼠死亡率并取小鼠肺组织检测菌体载量。结果 ELISA结果显示,OprI-IL-17、OprI-IL-2组小鼠血清中IgG、Ig A以及IgG亚类水平均显著高于各对照组(P<0.05),且其中各实验组IgG2a/IgG1的比值均大于1;IL-17、IL-2佐剂能够显著提高小鼠脾细胞上清中Th1/Th17型细胞因子INF-γ、IL-2、IL-17水平(P<0.05),而Th2型细胞因子IL-4、IL-6水平则无显著差异(P>0.05);此外,OprI-IL-17、OprI-IL-2组的淋巴细胞增殖最为显著(P<0.05);相较于各对照组,OprI-IL-17、OprI-IL-2组能够显著降低小鼠肺组织菌体载量以及小鼠死亡率(P<0.05),保护效果显著提高。结论 IL-17、IL-2佐剂均能有效增强Pa外膜蛋白OprI的体液、细胞免疫水平以及抗感染保护作用。

重组铜绿假单胞菌外膜蛋白OprI的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]构建铜绿假单胞菌外膜蛋白OprI原核载体,表达、纯化OprI蛋白,制备并鉴定小鼠多克隆抗体。[方法]通过分子克隆获得OprI蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得OprI蛋白,免疫小鼠制备OprI蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度;Western blotting检测抗血清特异性;DNAMAN与MEGA软件分析OprI蛋白系统进化关系。[结果]OprI重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果,以及蛋白表达、纯化条带大小与预测一致。ELISA法获得OprI抗血清滴度达1:3200倍,Western blotting证实抗血清具有很好的特异性。OprI序列的系统发生分析发现不同细菌存在很高的同源性。[结论]成功克隆、表达与纯化OprI蛋白,制备并鉴定小鼠多克隆抗体。为OprI蛋白免疫学功能研究奠定基础。

重组铜绿假单胞菌自组装纳米颗粒疫苗rePO-GroES的构建及免疫保护机制

目的构建重组铜绿假单胞菌自组装纳米颗粒疫苗rePO-GroES,在肺炎模型中评价其保护作用并阐明其免疫保护机制。方法通过基因融合的方式,将编码铜绿假单胞菌保护性抗原PcrV-OprI(rePO)的编码基因连接至伴侣分子GroES基因的C端,构建并制备rePO-GroES蛋白;肌注rePO-GroES免疫小鼠后检测小鼠血清中特异性抗体、抗体亚型效价和脾细胞中分泌IFN-γ、IL-17A和IL-4的细胞比例;使用急性铜绿假单胞菌肺炎模型,评估rePO-GroES的保护效果。结果溶液中rePOGroES组装成分布均一的纳米颗粒,平均粒径约为28.2 nm;rePO-GroES免疫组小鼠生存率显著高于rePO免疫组和对照组,rePO-GroES免疫组体质量减轻幅度、感染状态评分、病理损伤程度、肺部细菌量和炎症反应均低于rePO免疫组和对照组;rePO-GroES免疫组小鼠血清中抗rePO IgGs滴度显著高于rePO免疫组和空白组,其中IgG1含量最高;rePO-GroES免疫组小鼠脾细胞中分泌IFN-γ、IL-17A和IL-4的细胞数均显著高于rePO免疫组和对照组。结论自组装纳米颗粒疫苗rePO-GroES安全性良好、免疫原性强、保护效果显著,是一个良好的铜绿假单胞菌候选疫苗。

铜绿假单胞菌外膜蛋白Ⅰ的原核表达、纯化及免疫保护作用研究

铜绿假单胞菌外膜蛋白Opr I具有较强的免疫原性,在疫苗上具有开发前景。利用分子方法获得Opr I蛋白的表达菌株。Western blotting验证表明抗体能与Opr I蛋白特异性结合。SDS-PAGE电泳切胶纯化获得Opr I蛋白。将Opr I蛋白免疫小鼠并攻毒铜绿假单胞菌,发现Opr I蛋白激活的特异性免疫对小鼠铜绿假单胞菌感染的保护率达到57.14%,与对照组相比较达到显著性。采用正交试验设计,获得Opr I菌株最佳诱导表达条件为:加IPTG菌夜OD600值0.8,加IPTG终浓度0.3 mmol/L,诱导时间8 h,诱导温度28℃;菌株最佳培养条件为转速230 r/min,葡萄糖浓度0%,装液量50 m L。

Sm(OPr^i)β_2配合物掺杂改性醇酸树脂油墨基质的发光性能

合成了稀土钐配合物Sm(OPri)β2,并与油墨用改性醇酸树脂等复配,考察不同β-二酮如α-噻吩甲酰三氟丙酮(HTTA)、二苯甲酰甲烷(HDBM)、乙酰丙酮(HAA)对油墨基质的荧光性能的影响。紫外光谱(UV)结果表明,掺杂稀土配合物后,217nm处的紫外吸收峰显著增强。荧光光谱(FS)表明,掺杂配合物Sm(OPri)(DBM)2或Sm(OPri)(AA)2,油墨基质主要呈现位于460nm附近醇酸树脂荧光发射峰;而掺杂Sm(OPri)(TTA)2配合物在365nm波长激发下,在562nm、598nm、644nm处发射较强的Sm3+离子4G5/2→6H5/2,4G5/2→6H7/2,4G5/2→6H9/2跃迁的特征荧光。