Optiprep法分离大鼠肝星状细胞的实验研究

目的:建立一种合理、经济、便捷的大鼠原代肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)分离方法。方法:运用改良肝脏原位灌注D-Hanks后,改用Ⅳ型胶原酶和DNA酶Ⅰ离体灌注,10%、16%Optiprep密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞,台盼蓝排斥试验鉴定细胞活力,α-SMA免疫细胞化学法鉴定细胞纯度。结果:我们采用Optiprep密度梯度离心法成功分离出大鼠HSC,且活力、纯度均达到研究要求,HSC得率约为2×107/肝,细胞存活率为95%以上,纯度为90%以上。结论:本方法分离大鼠HSC合理、经济、便捷。

Optiprep连续密度梯度离心方法的建立

目的：试验不同条件,优化Optiprep密度梯度离心方法,建立最佳的Optiprep连续密度梯度,为纯化病毒提供良好的参数。方法：试验不同的旋转角度、重复次数、离心时间,以及用不同浓度的Optiprep制备连续密度梯度等条件,摸索制备连续密度梯度的最佳方案,将此最佳方案应用于纯化丙肝病毒（HCV）,并通过q RT-PCR验证纯化效果。结果：通过各种条件的摸索,确立了制备连续密度梯度的最佳方案,即制备10%~40%Optiprep连续密度梯度,在旋转角度为85°时,1号程序设置为30 r/min离心5 s,2号程序设置为0 r/min 15 s,重复1~2程序10次。将此程序用于纯化HCV,得到了较好的纯化效果。结论：建立了制备Optiprep连续密度梯度离心的方法,为进一步提高病毒的纯化效果提供了参数。

OptiPrep密度梯度分离液分离培养小鼠原代肝星状细胞的实验研究

目的寻找分离培养小鼠原代肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的有效方法。方法采用OptiPrep密度梯度分离液对BALB/c雄性小鼠HSC进行原位手工灌注分离培养。倒置荧光显微镜观察HSC自发荧光、油红O染色,α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及结蛋白(Desmin)免疫细胞化学染色鉴定原代细胞及传代培养的细胞。结果我们分离出高得率和高纯度的原代HSC,在倒置显微镜下328 nm波长的紫外光激发下自发蓝绿色荧光,油红O染色胞浆中脂滴呈红色,细胞核呈蓝色;在传2代培养的HSC中,α-SMA、Desmin染色阳性细胞胞浆为棕色颗粒,达100%阳性,全部活化。结论OptiPrep密度梯度分离液分离培养出高纯度、高得率的原代HSC。

基于OptiPrep的循环肿瘤细胞富集体系研究

建立一种简易高效的外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)富集方法。配比不同浓度的OptiPrep溶液梯度离心分离外周血各细胞成分,比较OptiPrep液与现行Ficoll液富集肿瘤细胞的效率、回收率、活性率。以此系统富集肿瘤患者血样中的CTC,结合免疫磁珠筛选、染色体原位荧光杂交和表面抗原免疫荧光技术精确鉴定CTC细胞。结果显示OptiPrep液以1.079g/mL的密度浓度在1 900r/min离心20min为最优分离条件。32例临床肿瘤患者血样的CTC检测实验中,均发现有循环肿瘤细胞的存在。结果表明基于OptiPrep液结合免疫磁珠筛选能有效富集外周血循环肿瘤细胞,为实验室常规开展CTC的计数、培养等研究奠定基础。

棉铃虫幼虫中肠细胞脂筏的制备及鉴定

脂筏是细胞膜上富含胆固醇、鞘脂类和糖基磷脂酰肌醇锚着蛋白的去垢剂不溶性微结构域,被认为是多种细胞膜孔毒素在细胞表面形成寡聚体的平台。为研究脂筏与Bt毒素在细胞膜上形成寡聚体膜孔的关系,本文对棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫中肠脂筏的制备与鉴定方法进行了研究。根据脂筏在低温(4℃)下不溶于去垢剂的特性,采用Triton X-100处理棉铃虫幼虫中肠刷状缘膜囊泡,溶解非脂质筏成分,以OptiPrep为介质进行密度梯度离心,分离去垢剂不溶组分,成功地得到了棉铃虫幼虫中肠上皮细胞的脂筏。再以脂筏的特有化学成分神经节苷脂GM1作为脂筏的标志分子,利用霍乱毒素β亚基能与GM1特异性结合的特性,以辣根过氧化物酶标记的霍乱毒素β亚基用点印迹法化学发光检测神经节苷脂的分布,从而对脂筏进行定性鉴定。结果表明我们建立的脂筏制备方法简便、易行,比传统的蔗糖梯度离心法大大缩短了制备所需时间。