Orbitrap Exploris 480质谱在定量蛋白质组学应用中的优化和评测

基于数据依赖的扫描模式(data-dependent acquisition,DDA)和数据非依赖的扫描模式(data-independent acquisition,DIA)的非标记定量(label-free quantitative,LFQ)和同位素标记TMT(tandem mass tag)定量是蛋白质组学定量中较常见的技术.本文利用最新的Orbitrap Exploris 480质谱,优化了DDA、FAIMS DDA、FAIMS DIA的非标记定量方法以及TMT定量策略的关键质谱参数,并将其应用在人细胞蛋白质组、单细胞蛋白质组、血浆蛋白质组和酵母蛋白质组分析.结果表明,在DDA实验中,设置碰撞能量为27、二级谱图的分辨率为15 K、最大离子注入时间为22 ms是最佳的参数组合.针对极微量样品200 pg~5 ng,可以根据样品量相应设置最佳的质谱参数.使用200 pg和500 pg的HeLa细胞样品,分别鉴定到1259和1725个蛋白质,从而实现了单细胞蛋白质组学的深度覆盖.在FAIMS DDA实验中,60 min或90 min梯度时选择CV-45V的补偿电压,120 min或150 min梯度时选择CV-45V-65V补偿电压组合,可以获得最佳的蛋白质鉴定结果.从293T蛋白质组中分别在60、120和150 min中鉴定6300、6994和7500个蛋白质.在FAIMS DIA实验中,使用CV-45V-65V双补偿电压切换,60个隔离窗口来获得最佳的蛋白质鉴定数目和定量重现性.在60 min内分别在293T细胞和去除高峰度的血浆中定量到7019个细胞蛋白和1077个血浆蛋白.在TMT定量实验中设置APD开启、"Precursor Fit"阈值70和Turbo TMT功能的组合同时增加了TMT定量蛋白质的数量和TMT定量的准确性.在TMT11-plex标记的酵母蛋白质组中60 min即可定量10989个多肽和2162个蛋白质.综上所述,本研究中优化的多种非标记定量和TMT定量方法为Orbitrap Exploris 480在蛋白质组学更广泛的应用提供了参考.