OsPIN1a基因在水稻根负向光性中的作用初探

为了探讨水稻生长素输出载体蛋白OsPIN1a与根负向光性的关系,根据GenBank数据库报道的OsPIN1a核苷酸序列,利用RT-PCR技术,设计特异引物从水稻cDNA中扩增得到生长素输出蛋白基因(OsPIN1a)。测序结果表明,OsPIN1a基因序列中GC含量达65.49%。构建该基因的GFP融合表达载体pCAMBIA-1301-OsPIN1a::GFP,对洋葱表皮细胞的瞬时表达分析表明,融合蛋白主要分布在细胞膜和细胞核内。以农杆菌介导法转化水稻中花11,PCR和GUS染色检测结果表明,目的基因片段已经整合到水稻基因组内;在单侧光照射下,转基因水稻种子根的负向光弯曲角度比野生型大约14.0%,转基因植株中OsPIN1a的表达水平也显著高于野生型植株,说明OsPIN1a可能在水稻根的负向光性反应中起重要作用。

水稻OsPIN1a基因体外表达及蛋白磷酸化活性位点分析

输出载体OsPIN1a是水稻PIN-FORMED(PIN)的家族成员之一,参与调节生长素在植物组织中的不均衡分布。然而,OsPIN1a蛋白的功能结构域如何调节激素的极性运输仍需进一步探讨。本研究拟以日本晴水稻为材料,利用OsPIN1a基因的非编码区设计引物,特异地克隆目的基因,并借助Quickchange XL site-directed mutagenesis技术分别构建单突变[pET30-OsPIN1a(Ser233/Ala)和pET30-OsPIN1a(Ser254/Ala)]及双突变[pET30-OsPIN1a(Ser233/Ala和Ser254/Ala)]表达载体,通过体外蛋白表达和磷酸化活性分析,明确了OsPIN1a蛋白水解结构域中Ser-233和Ser-254是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PINOID,PID)的磷酸化活性位点,此结果为进一步研究生长素的极性运输机制提供参考。

OsPIN1a基因在水稻植株不同组织表达与定位研究

目的:为了探讨水稻生长素极性运输输出载体蛋白OsPIN1a的在水稻不同组织的作用和分布。方法:以带有GFP和GUS标记的转OsPIN1a基因水稻和野生型中花11水稻为研究材料。通过PCR方法检测抗性标记基因潮霉素基因判断植株是否阳性;通过半定量RT-PCR方法分析OsPIN1a基因在转基因植株幼穗、叶片、根系的表达;通过GUS组织染色检测OsPIN1a在幼穗、叶片、根系中的活性;通过激光共聚焦显微镜观察OsPIN1a-GFP蛋白在根尖亚细胞定位情况。结果:实验所用的水稻株系均为转基因株系;RT-PCR检测发现,在根尖、叶片和幼穗中hpt和OsPIN1a基因均有表达;GUS组织染色结果表明,幼穗、叶片、根系均有GUS活性,其中在幼嫩的组织中表达量最大,如刚萌发种子胚芽鞘、花药和柱头;GUS活性受外源生长素诱导而受生长素极性运输抑制剂(TIBA)的抑制;激光共聚焦显微镜观察发现,OsPIN1a-GFP蛋白主要分布在根尖细胞膜上。结论:实验表明OsPIN1a基因参与了水稻各个器官和组织的发育,这些组织发育可能都受到生长素极性运输的调控。

水稻OsPIN1b基因GFP融合表达载体构建及转化水稻的研究

水稻生长素输出载体OsPIN1a可能参与调控水稻根负向光性反应。为了进一步研究其他OsPIN基因与水稻根负向光性的关系,以GenBank数据库报道的OsPIN1b核苷酸序列为基础,设计特异引物以RTPCR从水稻cDNA中扩增得到OsPIN1b基因。测序结果表明获得完整的OsPIN1b基因ORF序列;生物信息学分析表明,OsPIN1b基因序列全长1 665 bp,与已报道的序列相吻合,其GC含量为64.08%,编码554个氨基酸。进一步构建了该基因的GFP融合表达载体pCAMBIA-1301-OsPIN1b∷GFP并转化水稻中花11,分子检测和GUS染色表明外源片段已经成功整合到水稻基因组,为研究OsPIN1b在水稻根负向光性中的作用奠定基础。

水稻OsPIN1d基因克隆与转化及其在水稻根负向光性中的作用

生长素极性运输输出载体OsPIN1基因家族可能参与调控水稻根负向光性,其中OsPIN1a和OsPIN1b参与水稻根负向光性已得到证实。为了研究OsPIN1d基因与水稻根负向光性形成的关系,依据GenBank数据库中OsPIN1d(Accession number:BR000830)的核苷酸序列,设计特异性引物,通过RT-PCR从水稻根尖的cDNA中扩增出完整的OsPIN1d基因全长。生物信息学分析表明,OsPIN1d的序列全长为1 497bp,编码554个氨基酸,GC含量为64.08%;氨基酸序列多重比对及系统发育树构建表明,OsPIN1d与水稻OsPIN1b、玉米OsPIN4以及拟南芥AtPIN2、OsPIN1c、OsPIN1a和AtPIN1等基因的遗传距离较近。通过构建融合超表达载体pCAMBIA-1301-OsPIN1d∷GFP,转化并获得其转基因水稻,经RT-PCR检测和GUS染色结果显示,外源片段已成功整合到水稻基因组内,并在根部高效表达;受单侧光照射后,转基因水稻种子的根负向光性明显大于野生型,且向光侧OsPIN1d-GFP荧光密度明显弱于背光侧。研究表明,OsPIN1d参与了水稻根负向光性的IAA和NAA的运输,从而促进了根负向光性的形成。