水稻多胺转运蛋白OsPUT1基因RNAi载体的构建及遗传转化

在植物中,多胺(腐胺,亚精胺和精胺)参与许多生理过程,包括胚胎发育、器官形成、花芽发育,叶片衰老,花粉管生长、果实的发育和成熟,生物和非生物胁迫的响应。但是,PAS具有内在毒性和多重功能,细胞内的PA含量受到严格控制,受转运体的调节。因此,在水稻中研究水稻多胺转运蛋白OsPUT1的功能至关重要。本研究以水稻多胺转运蛋白基因OsPUT1为研究对象,通过构建OsPUT1-RNAi载体,借助根癌农杆菌介导水稻遗传转化,将OsPUT1的RNAi表达框转到水稻基因组中;经过PPT抗性筛选与PCR鉴定,成功获得了34株转基因水稻。对其中的7株转基因苗进一步作RT-PCR检测,显示有5株OsPUT1基因表达下调,实现了设计目标。这些转基因水稻为进一步研究OsPUT1的功能与作用机制提供了良好的遗传材料。

水稻多胺转运蛋白OsPUT1基因过表达载体构建及遗传转化

多胺（腐胺,亚精胺和精胺）不仅参与植物的生长发育调控,还与生物胁迫和非生物胁迫的抗性密切相关。由于多胺具有多重功能,细胞内多胺含量受到严格控制,例如受转运的调节。因此,在水稻中研究水稻多胺转运蛋白OsPUT1的功能至关重要。本研究以OsPUT1为研究对象,借助生物信息学分析,发现OsPUT1蛋白是一种疏水性蛋白,具有12个跨膜结构,定位于细胞核内。通过构建OsPUT1基因过表达载体,借助根癌农杆菌将目的基因转入到水稻愈伤组织的基因组中,以潮霉素进行筛选,通过PCR鉴定,成功获得了20株转基因植株。对其中的4株转基因水稻进一步作实时荧光定量PCR检测,显示全部转基因苗OsPUT1基因表达明显上调,实现了设计目标。这些水稻为进一步研究OsPUT1的功能提供了良好的材料。

OsPUT1基因三个不同位置的RNA干扰效果

RNA干扰是一种双链RNA引发的转录后基因沉默技术,具有特异性和高效性,已成为一种基因功能研究的有效手段。在RNA干扰技术中,干扰片段的选取方式会影响基因沉默的效果。但是,目前并无选取干扰片段的固定标准。本研究以水稻多胺转运蛋白基因OsPUT1为对象,在CDS前部、中部和后部分别设计了三种不同干扰片段,构建基因三个RNAi载体,借助农杆菌EHA105介导水稻遗传转化,得到三种转基因苗;通过RT-PCR和Q-PCR技术检测目的基因的表达,结果显示三个干扰部位都具有一定的沉默效果,且在CDS的中间位置干扰效果最好。说明OsPUT1在进行RNAi载体构建时,应考虑在CDS的中间位置进行干扰。

Disruption of three polyamine uptake transporter genes in rice by CRISPR/Cas9 gene editing confers tolerance to herbicide paraquat

Weeds are a major biotic constraint that can cause dramatic crop production losses.Herbicide technology has been widely used by farmers as the most cost-effective weed control measure,and development of new strategy to improve herbicide tolerance in plants is urgently needed.The CRISPR/Cas9-based genome editing tool has been used in diverse applications related to agricultural technology for crop improvement.Here we identified three polyamine uptake transporter(PUT)genes in rice that are homologous to the Arabidopsis AtRMV1.We successfully demonstrate that CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of OsPUT1/2/3 greatly improves paraquat resistance in rice without obvious yield penalty.Therefore,manipulation of these loci could be valuable for producing transgene-free rice with improved herbicide resistance in future.