OsZEP2基因沉默对2,2′,5-三氯联苯胁迫下水稻抗氧化反应的影响

载脂蛋白基因OsZEP2沉默突变株(mutation type,MT)和野生型(wide type,WT)的水稻愈伤组织被暴露于10、50、100μg·mL-1的2,2′,5-三氯联苯(PCB18)的培养基3 d后,通过比较两种水稻愈伤组织的生长、PCB18积累和抗氧化反应的变化情况,来探究水稻在多氯联苯胁迫下OsZEP2基因对水稻解毒响应机制的影响.实验发现,PCB18可以抑制WT和MT的生长,但PCB18的中浓度胁迫对两种愈伤组织生长的促进作用十分明显,即有"hormesis"效应.PCB18对MT生长的抑制高于WT,低浓度CB18(10μg·mL-1)胁迫抑制MT生长(4.5%),中浓度PCB18(50μg·mL-1)促进MT生长(8.3%),高浓度PCB18(100μg·mL-1)抑制MT生长(9.9%).OsZEP2基因沉默后促进了PCB18在愈伤组织的积累,并导致培养基中的PCB18去除效率提高.OsZEP2基因沉默降低类胡萝卜素含量,导致MT本身的氧化胁迫增强;并且在不同浓度PCB18胁迫下,MT的类胡萝卜素含量稳定,MT的抗氧化反应活性低与WT.在PCB18胁迫下,MT体内的SOD和CAT酶的活性都明显低于WT,这可能是导致膜脂过氧化程度显著升高的重要原因之一.另外,两种嫩弱的愈伤组织中的POD酶抗氧化活性较弱,但OsZEP2沉默可以促进POD酶活性升高.因此,OsZEP2基因沉默导致植物体内的PCB18积累增多,抗氧化反应减弱,不利于植物对PCB18毒性的抵抗.

菊芋HtMYB2基因VIGS体系构建与功能验证

颜色作为一种重要的农艺性状,影响作物的价值。紫皮菊芋与白皮菊芋相比,具有较好的外观颜色、营养价值和商品价值。本研究旨在探究菊芋块茎表皮颜色形成的潜在机制。通过前期转录组测序技术对紫皮和白皮菊芋块茎表皮分析,筛选得到与花青素合成代谢相关转录因子HtMYB2。本研究以紫皮菊芋品种为材料,利用VIGS技术将HtMYB2进行基因沉默,对其功能进行验证。结果表明侵染后的菊芋块茎表皮颜色变浅,花青素含量显著下降为15.34 mg/g;同时RT-PCR结果显示HtMYB2基因表达量为2.06,与对照组相比显著降低,沉默效率为73.96%,推测HtMYB2基因的沉默使菊芋块茎中花青素基因的表达受阻,花青素合成功能减弱,导致花青素含量降低,表明HtMYB2基因在花青素合成途径中起正调控作用。本研究为菊芋块茎表皮花青素的生物合成机理提供理论依据,并进一步揭示了该基因在调控块茎颜色和花青素合成途径中的重要性。

广藿香PcGA2ox1基因克隆、VIGS载体构建和表达分析

赤霉素2-氧化酶(gibberellin 2-oxidases,GA2ox)是赤霉素(GAs)代谢途径关键酶,调节活性GAs降解,在植物株型调控中发挥重要作用。为探寻GA2ox基因在广藿香中的功能,本研究对广藿香PcGA2ox1基因进行克隆,得到561 bp的CDS序列。生物信息学分析结果表明,PcGA2ox1蛋白编码186个氨基酸,为亲水性蛋白,分子量为20.98 kDa,等电点为5.81,不含信号肽,无跨膜结构域,具有GA2ox超基因家族的保守结构域,主要定位在细胞核。系统发育分析结果显示,PcGA2ox1基因与丹参GA2ox7的亲缘关系最为密切。qRT-PCR结果显示,PcGA2ox1基因在广藿香中的表达具有组织特异性,叶中表达量最高,根中表达量最低。用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术侵染广藿香的结果显示,侵染两周后,PcGA2ox1基因表达量比阴性对照下降83%,比空白对照下降71%,沉默效果明显。本研究结果可为深入了解PcGA2ox1结构、功能和作用机理奠定基础,并为广藿香优良品种选育提供参考。

人宫颈癌Hela细胞TPX2基因沉默对放射敏感性的影响

目的观察TPX2基因沉默的人宫颈癌Hela细胞对X射线的敏感性。方法将宫颈癌Hela细胞分为TPX2-siRNA组、NC-siRNA组、Control组,TPX2-siRNA组转染TPX2-siRNA,NC-siRNA组转染NC-siRNA即空载体siRNA,Control组仅加入转染试剂。采用实时荧光定量PCR、Western blot分别检测各组细胞中的TPX2 mRNA与蛋白。采用CCK8法检测不同剂量(0、2、4、6 Gy)X线照射后TPX2-siRNA组细胞的增殖抑制率。采用流式细胞术检测4 Gy X线照射前后TPX2-siRNA组细胞的凋亡率。结果与NC-siRNA组、Control组相比,TPX2-siRNA组细胞TPX2 mRNA、蛋白相对表达量降低(P均<0.05)。TPX2-siRNA组细胞接受0、2、4、6 Gy X线照射后,细胞增殖抑制率分别为4.71%±0.15%、5.26%±0.69%、6.64%±0.13%、15.19%±0.73%,两两组间比较P均<0.05。TPX2-siRNA组细胞接受4 Gy X线照射前后细胞凋亡率分别为11.43%±0.03%、12.68%±0.03%,两者比较P<0.05。结论 TPX2基因沉默的人宫颈癌Hela细胞对X射线的敏感性增加。

苏云金芽孢杆菌沉默基因cry2Ab3在大肠杆菌中表达及杀虫活性研究

对苏云金芽孢杆菌C0 0 2菌株cry2Ab基因阳性克隆pHT3 1 5 2Ab进行亚克隆和序列测定 ,在CenBank注册后经国际Bt杀虫蛋白基因委员会正式命名为cry2Ab3。序列分析表明该基因含有芽孢杆菌特异的RBS序列 ,但没有功能性启动子 ,为沉默基因。根据大肠杆菌T7表达载体pET 2 1b克隆位点和cry2Ab3开放阅读框架 (ORF)两端序列 ,设计合成一对特异引物L2ab5和L2ab3 ,高保真PCR扩增获得cry2Ab3完整ORF ,经酶切、连接构建了重组表达质粒pET 2Ab3。表达质粒导入大肠杆菌BL2 1 (DE3 ) ,IPTG诱导后 ,SDS PAGE电泳证实了cry2Ab3的表达。生物测定显示诱导培养物对棉铃虫初孵幼虫和小菜蛾二龄幼虫具有杀虫活性 ,能明显抑制二化螟二龄幼虫生长 ,但对甜菜夜蛾和玉米螟没有明显活性。进一步提取Cry2Ab3蛋白 ,生测结果表明其对棉铃虫LC50 为 3 2 5 5 μg g。

补肾活血汤水提物调控Cbfal/RUNX2基因沉默骨髓间充质干细胞SP7/Osterix及碱性磷酸酶的表达

背景:补肾活血汤可以促进骨髓间充质干细胞成骨分化,探究分子机制利于推向临床。目的:探讨补肾活血汤水提物对Cbfal/RUNX2基因沉默的骨髓间充质干细胞Osterix、碱性磷酸酶表达的影响。方法:骨髓贴壁筛选法分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞,Cbfal/RUNX2基因沉默慢病毒转染骨髓间充质干细胞。取第3代骨髓间充质干细胞(空白对照组)、慢病毒沉默骨髓间充质干细胞(沉默组)和阴性病毒载体预处理骨髓间充质干细胞(阴性对照组),以及上述3组骨髓间充质干细胞加入100 mg/L补肾活血汤水提物干预3 d后,检测RUNX2、Osterix蛋白和mRNA表达以及碱性磷酸酶活性。结果与结论:(1)Cbfal/RUNX2基因沉默慢病毒转染效率达约90%;(2)与空白对照组和阴性对照组比较,沉默组骨髓间充质干细胞RUNX2和Osterix的蛋白及mRNA表达均下降,碱性磷酸酶活性也明显下降,差异有显著性意义(P<0.01);(3)补肾活血汤水提物干预后,沉默组骨髓间充质干细胞RUNX2、Osterix的表达和碱性磷酸酶活性明显增加,差异有显著性意义(P<0.01);(4)结果表明,补肾活血汤水提物可以促进骨髓间充质干细胞的RUNX2、Osterix表达,亦增加了碱性磷酸酶活性,从而促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

β-arrestin2抗基因RNA表达载体的构建及其基因沉默效应鉴定

目的吗啡耐受与神经元μ阿片受体持续脱敏感化有关,而μ阿片受体调控蛋白β-arrestin2在其中起着关键性作用,因此β-arrestin2有可能成为抑制吗啡耐受状态的有效靶点。文中构建携带β-arrestin2抗基因RNA的表达载体pGPU6/GFP/agRNAs,并评价其用于基因沉默研究的可行性。方法根据β-arrestin2基因转录起始位点序列,从-14处开始至+13处结束,每隔一个碱基,依次合成9条21个碱基长度的抗基因RNA片段,并分别构建入质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo。利用脂质体Lipofectamine介导的基因转染技术,分别将各个表达载体转染NG108-15细胞,于转染后第5天分别取转染不同抗基因RNA片段的细胞提取总RNA,应用realtime PCR和Western blot检测细胞β-arrestin2的表达,评价其基因沉默效应。结果筛选出1个表达具有基因沉默效应的抗基因RNA表达载体pGPU6/GFP/Arrb9。Realtime PCR结果显示NG108-15细胞转染该片段后,β-arrestin2 mRNA和蛋白表达水平均下降(P<0.05),下降程度达95%。结论携带β-arrestin2抗基因RNA的表达载体可有效下调NG108-15细胞β-arrestin2的表达,实现基因沉默效应。

CDK2 shRNA慢病毒载体的构建及其基因沉默效应

目的构建CDK2 shRNA慢病毒载体,并在黑色素瘤细胞B16-F1中鉴定其基因沉默效应。方法体外构建3个慢病毒重组目的质粒p UL-CDK2-shRNAs和1个阴性对照慢病毒重组质粒p UL-NC-shRNA,转化感受态细胞,PCR鉴定后进一步测序验证;293T细胞中测定病毒滴度;用重组慢病毒感染B16-F1细胞测定其感染效率,RT-PCR和Western印迹检测其对B16-F1细胞中CDK2的基因沉默效应。结果 PCR鉴定后进一步测序表明,成功构建了重组慢病毒质粒;病毒滴度为4.5×107~5.5×107TU/ml;用重组慢病毒感染B16-F1细胞,当感染复数(MOI)为10时,感染效率可达90%;RT-PCR和Western印迹结果表明,与未感染组和NC-shRNA感染组细胞相比,CDK2-shRNA1、CDK2-shRNA2、CDK2-shRNA3感染的细胞中CDK2 mRNA和蛋白表达均受到不同程度抑制(P<0.05),以CDK2-shRNA3感染组的抑制率最高,RT-PCR和Western Blot检测其抑制率分别为78.5%±4.23%和70.5%±3.54%。结论利用RNAi技术成功构建了3种CDK2-shRNA重组慢病毒载体,均可有效感染B16-F1细胞并具有一定的基因沉默效应,其中以针对靶位点1012-1020的p UL-CDK2-shRNA3基因沉默效应最强,为进一步研究CDK2基因沉默对黑色素瘤化疗敏感性的影响奠定了基础。

应用RNAi沉默STAT3基因促裸鼠移植瘤细胞凋亡及对Bax/Bcl-2基因表达的影响

目的应用RNAi技术沉默信号转导子与转录活化子3(STAT3)基因,探讨其对人乳腺癌裸鼠移植瘤的细胞凋亡及其对Bax/Bcl2基因表达的影响。方法于雌裸鼠皮下种植MCF7细胞,肿瘤长至一定大小时,随机分为盐水对照(A)组、空质粒对照(B)组及实验(C)组。于肿瘤局部分别注射盐水、psilencer1.0U6空质粒和psilencer1.0U6STAT3siRNA重组质粒。当A组肿瘤长至足够大时处死全部动物,取肿瘤,测其大小及重量,行HE及免疫组化染色,同时用Westernblot检测STAT3,Bax,Bcl2基因的表达水平。结果C组肿瘤瘤块的体积和重量明显小于A,B组(P<0.01)。免疫组化及HE显示C组肿瘤中心区出现大面积细胞坏死及细胞凋亡征象,STAT3免疫组化呈阴性,而A,B组无此现象。Westernblot显示C组STAT3的表达明显低于A,B组(P<0.01),而Bax的表达明显高于A,B组(P<0.05),各组Bcl2的表达水平差异无显著性(P<0.05)。结论应用RNAi技术沉默STAT3基因可以降低人乳腺癌裸鼠移植瘤中STAT3的表达,同时引起Bax基因的表达上调,导致细胞凋亡进而抑制肿瘤的生长。

蛋白酶激活受体-2基因靶向shRNA表达质粒的构建及转染食管癌细胞致沉默效应的研究

目的:构建靶向蛋白酶激活受体-2(PAR-2)基因的shRNA表达质粒,建立PAR-2基因沉默的食管癌EC109稳定细胞株。方法:针对人PAR-2的mRNA序列,设计并体外合成编码shRNA的两条特异性寡核苷酸序列,分别插入pGFP-V-RS质粒中构建2个shRNA表达质粒(PAR-2shRNA-1、PAR-2shRNA-2),经过鉴定,然后将表达质粒转染至食管癌细胞EC109中,经嘌呤霉素筛选,获得稳定干扰的细胞株,运用RT-PCR和WesternBlot检测PAR-2的表达。结果:PAR-2shRNA-1转染人食管癌细胞EC109后,PAR-2基因表达在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建针对PAR-2基因的shRNA表达质粒,转染食管癌细胞EC109,能有效抑制该细胞株PAR-2基因的表达。

PAR-2基因沉默对食管癌EC109细胞增殖及侵袭转移的影响

目的:研究PAR-2基因沉默对食管癌EC109细胞增殖和侵袭迁移能力的影响。方法:运用MTT及流式细胞术法检测sh RNA-PAR-2 EC109细胞增殖能力及细胞周期的变化;Transwell小室法检测sh RNAPAR-2 EC109细胞侵袭和迁移能力的变化。结果:sh RNA-PAR-2 EC109细胞增殖低于正常对照组,24、48、72 h的细胞抑制率分别为15.92%、24.89%、32.28%,与正常对照组比较差异有显著性(P<0.05),而转染试剂组和阴性质粒转染组与正常对照组比较差异无显著性(P>0.05)。sh RNA-PAR-2 EC109细胞发生S期阻滞,转染24、48、72 h S期细胞比例分别为(32.79±4.06)%、(26.54±1.37)%和(33.45±2.46)%,与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。在侵袭实验中,sh RNA-PAR-2 EC109细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数为19.6±2.11,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。在迁移实验中,sh RNA-PAR-2 EC109细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数为24.2±2.82,与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。结论:sh RNA-PAR-2 EC109细胞的增殖减慢,侵袭及迁移能力降低。

沉默Bcl2、Bak1基因表达对成骨肉瘤MG-63细胞增殖及成骨能力的影响

目的探讨沉默Bcl2、Bak1基因表达对成骨肉瘤MG-63细胞增殖及成骨能力的影响。方法收集对数生长期MG-63细胞,随机分为sh Bcl2组、sh Bak1组、共转染组和空白对照组。sh Bcl2组、sh Bak1组、空白对照组分别单独转染sh Bcl2、sh Bak1重组腺病毒和空载腺病毒,共转染组同时转染sh Bcl2及sh Bak1重组腺病毒。转染48 h,采用MTT法检测细胞增殖率,对硝基苯磷酸盐法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,Western blotting法检测成骨相关蛋白骨形态发生蛋白4(BMP4)、骨桥蛋白(OPN)、Runt相关转录因子2(Runx2)、TNF-α表达。结果 sh Bcl2组细胞增殖率、ALP活性及BMP4、OPN、Runx2相对表达量均低于空白对照组,TNF-α相对表达量高于空白对照组(P均<0.01)。sh Bak1组细胞增殖率、ALP活性及BMP4、OPN、Runx2相对表达量均高于空白对照组,TNF-α相对表达量低于空白对照组(P均<0.01)。空白对照组与共转染组细胞增殖率、ALP活性、BMP4、OPN、Runx2、TNF-α相对表达量比较均无统计学差异(P均>0.05)。结论沉默Bcl2基因表达可抑制MG-63细胞增殖及成骨能力,沉默Bak1基因则具有相反的作用;Bcl2与Bak1共同参与MG-63细胞的凋亡及成骨过程。

XRCC2基因沉默对结肠癌细胞放射敏感性的影响

目的探讨XRCC2基因沉默对人结肠癌细胞放射敏感性的影响。方法实验分组为control组(结肠癌T84细胞)、shRNA-SC组(T84/shRNA-SC细胞)和shRNA-XRCC2组(T84/XRCC2-shRNA细胞)。经X-射线照射后,采用碱性"彗星"电泳法测定结肠癌细胞的DNA损伤修复,采用流式细胞术检测结肠癌细胞的细胞周期和细胞凋亡率。结果照射前shRNA-XRCC2组细胞显示出拖尾彗星;照射后shRNA-XRCC2组细胞尾长、尾矩或Olive尾矩均明显高于control组细胞,差异有统计学意义(t=6.95、5.34、9.43,P<0.01)。照射前shRNA-XRCC2组细胞与control组细胞相比,停留在G2/M期较多(14.36%±1.32%),差异有统计学意义(t=10.46,P<0.01);照射后shRNA-XRCC2组滞留在G2/M期的细胞显著增加(38.51%±4.15%),与control组细胞相比差异有统计学意义(t=3.92,P<0.05)。照射前shRNA-XRCC2组细胞凋亡率(17.40%±4.81%)明显高于control组细胞(t=8.59,P<0.01);照射后shRNA-XRCC2细胞的凋亡率显著增加(33.16%±2.69%),与control组细胞相比差异有统计学意义(t=15.31,P<0.01)。结论 XRCC2基因沉寂提高了结肠癌细胞的放射敏感性,XRCC2有望在结肠癌的临床放射治疗敏感性中作为一重要的靶向基因。

hTERT基因沉默对乳腺癌细胞生物学特性及COX-2表达的影响

目的本研究探讨hTERT基因沉默后对乳腺癌细胞生物学特性及环氧化酶-2(COX-2)的影响。方法设计合成特异性针对hTERT mRNA的siRNA,电转染入乳腺癌细胞,以致目的基因沉默。应用RT-PCR及Western blot法检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的mRNA及蛋白的表达状况;应用流式细胞仪检测细胞周期;并通过CCK-8增殖实验检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力;经小室侵袭实验检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力。利用免疫组织化学法检测COX-2蛋白的表达。结果 hTERT基因沉默48h后,hTERT转染组在沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的mRNA及蛋白表达呈现明显降低(P<0.05);细胞周期检测结果示乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞停滞在G0/G1周期,S期的细胞数目减低,三组比较统计学差异明显(P<0.05);CCK-8增殖实验结果表明乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞在hTERT转染组的增殖得到显著抑制(P<0.05);小室侵袭实验结果表明,hTERT转染组穿过滤膜的细胞数量明显减少(P<0.05);免疫组织化学法检测结果显示,COX-2蛋白在hTERT转染组的表达明显降低,并与hTERT基因的表达相关联。结论 hTERT基因沉默后对乳腺癌细胞的增值和迁移能力均有影响,并能降低COX-2蛋白的表达,从而改善乳腺癌患者预后。

CIP2A在卵巢癌癌组织中的表达及其基因沉默后对肿瘤细胞侵袭和迁移能力的影响

目的探讨蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)在卵巢癌癌组织中的表达及其基因沉默后对肿瘤细胞侵袭、迁移能力的影响。方法收集2015年7月～2016年7月在我院实施卵巢癌手术的患者47例卵巢癌组织为卵巢癌组,选择同期行卵巢良性病变部分切除时的5例正常卵巢组织为正常组,测定组织中CIP2A的表达水平。应用siRNA干扰卵巢癌细胞系A2780和SKOV3的CIP2A表达,将细胞分为对照组和干扰组,采用MTT法检测两组细胞增殖,Transwell检测两组细胞侵袭和迁移能力,Western Blot检测E-钙黏蛋白(E-cad)、基质金属蛋白MMP-2、MMP-9、转移性肿瘤抗原1(MTA1)蛋白的表达水平。结果与正常组比较,卵巢癌组CIP2A蛋白和CIP2A mRNA表达量显著升高(P<0.05);与对照组相比,干扰组A2780和SKOV3细胞增殖率、侵袭和迁移力显著下降(P<0.05),E-cad的蛋白表达量显著升高(P<0.05),MMP-2、MMP-9和MTA1的蛋白表达量显著下降(P<0.05)。结论 CIP2A在卵巢癌组织中具有高表达,可有效调节细胞侵袭和迁移相关蛋白的表达,调控细胞的侵袭和迁移力。

氚示踪法评估RNAi介导Mfn2基因沉默对小鼠体内物质代谢的影响

采用同位素示踪技术研究RNAi介导线粒体融合素基因-2(Mfn2)沉默小鼠体内物质代谢变化。构建了含Mfn2短发卡RNA(short hair RNA,shRNA)干扰质粒和阴性对照质粒。24只BALB/c小鼠分为转染组和阴性对照组,每组各12只,转染组经尾静脉注射Mfn2干扰质粒,对照组注入阴性对照质粒。质粒注入5 d后,将氚水(3H2O)或氚标记葡萄糖(3-3H-Glucose)经腹腔或尾静脉注射到小鼠体内,留取血标本和组织标本,用液体闪烁计数仪测定标本放射性浓度,计算小鼠组织脂肪酸合成率和肝脏葡萄糖生成率,两组间均数比较采用t检验。结果显示,Mfn2基因转染组小鼠肝脏葡萄糖生成率为49.43±16.31,明显高于阴性对照组的24.91±4.07(P<0.05),肝脏、肌肉、心脏、脂肪组织的脂肪酸合成率分别为0.10±0.00、9.12±1.90、1.18±0.28、11.11±1.31,显著低于阴性对照组0.79±0.07,70.52±13.95,53.88±9.90,45.43±5.91。以上结果表明,Mfn2基因在体内葡萄糖和脂肪酸代谢中起重要作用。

β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体体外基因沉默效应研究

目的:探讨β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体在体外工具细胞中的基因沉默效应及其携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达。方法:用构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒感染NG108-15细胞,实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测β-arrestin2抗基因RNA慢病毒对工具细胞的β-arrestin2 mRNA和蛋白表达的下调作用,以及该病毒所携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达。结果:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒能显著降低工具细胞中β-arrestin2 mRNA和蛋白的表达,与对照组相比实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测的沉默效率分别为79%和82%(P<0.05)。感染病毒组的NG108-15细胞的铁蛋白表达量显著升高,是对照组细胞的2.29倍(P<0.05)。结论:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在工具细胞中对β-arrestin2基因具有显著的沉默效应,该病毒携带的铁蛋白报告基因在工具细胞中表达。成功验证了β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在体外的基因沉默效应和铁蛋白报告基因的表达,为该病毒的在体研究奠定了基础。

Sir2基因与端粒沉默的研究进展

转录沉默是基因表达调控的重要方式,它对于保持细胞的不同分化状态和维持染色质的稳定性至关重要。沉默信息调节因子2(silent information regulator 2,Sir2)参与酵母交配型基因沉默(silentmating type)、端粒区基因沉默以及核糖体DNA(rDNA)沉默。端粒区的基因沉默可能是酵母衰老过程中的机制之一,处于沉默状态的染色质中的许多基因无转录活性,可能由此影响酵母生长。

沉默Chk1基因对DADS阻滞人胃癌BGC823细胞G2/M期的影响

目的:探讨沉默Chk1基因在二烯丙基二硫(DADS)诱导人胃癌BGC823细胞G2/M期阻滞中的作用。方法:采用RNAi技术沉默BGC823细胞Chk1基因,q-PCR与Western blot检测Chk1 mRNA与蛋白表达。流式细胞术检测DADS作用与Chk1基因沉默BGC823细胞周期分布情况。Western blot检测Cdc25C与cyclin B1表达。结果:流式细胞术显示,15 mg·L-1DADS作用BGC823细胞12、24、36、48 h后,G2/M期细胞呈时间依赖性增加(P<0.05)。Chk1沉默BGC823细胞Chk1 mRNA与蛋白表达下调(P<0.05)。沉默Chk1后,G2/M期细胞较对照组降低(P<0.05)。DADS处理后,对照组G2/M细胞高于Chk1沉默组(P<0.05)。Chk1基因沉默后Cdc25C和Cyclin B1表达较对照组增加(P<0.05)。DADS处理对照组后,Cdc25 C和Cyclin B1表达较未处理组降低(P<0.05)。DADS处理Chk1沉默组Cdc25 C和Cyclin B1表达较Chk1沉默下调(P<0.05)。结论:Chk1沉默可通过促进Cdc25C和Cyclin B1表达减弱DADS阻滞G2/M的作用,DADS阻滞G2/M的检查点是Chk1。

沉默抑制子CMV 2b基因的克隆及其反向重复植物表达载体的构建

从安徽亳州采集表现明显CMV症状的烟草样本,取ELISA检测阳性反应最强的样本提取总RNA。设计特异性引物扩增CMV RNA2部分片段,克隆并测序。其中包含的2b基因全长336个核苷酸,编码111个氨基酸。将来源于安徽烟草的CMV 2b基因与其它CMV 2b基因进行序列比对,结果表明,来源于安徽烟草的CMV2b基因与来源于韩国的2b基因AF033667的核苷酸序列相似性最高,达98.8%。构建2b基因系统关系树,也表明来源于安徽烟草的CMV 2b基因与AF033667亲缘关系最近。以安徽CMV 2b为模板,分别扩增大小约为300 bp的正向片段CMV 2b(r)和反向片段CMV 2b(i)。先后将反向片段CMV 2b(i)和正向片段CMV 2b(r)分别插入载体pSK-In所含intron两侧,获得重组质粒pSK-2b(r)-In-2b(i)。再将含intron的正反向片段插入pBIN438,最终得到含CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b(r)-In-2b(i)。