高良姜素通过激活cGAS/STING信号通路抑制骨肉瘤MG63细胞的恶性生物学行为

目的:探讨高良姜素(Gal)是否通过调节cGAS/STING信号通路影响骨肉瘤MG63细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡。方法:体外培养人骨肉瘤MG63细胞,分别使用0、5、15、25、50、100、200μmol/L的Gal培养48 h后,CCK-8法检测Gal对细胞活力的影响。将MG63细胞分为对照组(未处理细胞)、Gal低浓度组(Gal-L组,50μmol/L Gal处理)、Gal高浓度组(Gal-H组,100μmol/L Gal处理)和Gal-H+STING抑制剂组(Gal-H+H-151组,100μmol/L Gal+8μmol/L H-151处理)。采用EdU染色法、划痕愈合实验、Transwell小室法、流式细胞术检测各组细胞增殖活力、迁移、侵袭和凋亡能力,WB法检测各组细胞中cGAS、STING蛋白的表达水平。结果:与对照组比较,Gal-L组、Gal-H组细胞增殖活力、迁移、侵袭能力均显著降低(均P<0.05),细胞凋亡率和cGAS、STING蛋白表达水平均显著升高(均P<0.05);与Gal-H组比较,Gal-H+H-151组细胞增殖活力、迁移和侵袭能力均显著升高(均P<0.05),细胞凋亡率和cGAS、STING蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05)。结论:Gal可能通过激活cGAS/STING信号通路抑制骨肉瘤MG63细胞增殖、迁移、侵袭并促进细胞凋亡。

骨碎补UPLC指纹图谱与人骨肉瘤细胞MG63中碱性磷酸酶活性的谱效关系研究

建立骨碎补生品和砂烫品提取物的UPLC指纹图谱,并研究骨碎补提取物与人骨肉瘤细胞MG63中碱性磷酸酶(ALP)活性之间的谱效关系。采用UPLC法建立骨碎补生品和烫品的指纹图谱并通过UPLC-Q-TOF MS法对其化学成分进行鉴别;通过测定MG63细胞中ALP活性检测骨碎补提取物对MG63细胞成骨分化的影响;采用灰色关联度分析、双变量相关性分析以及偏最小二乘回归分析法分析骨碎补生品和烫品的UPLC特征指纹峰与其促ALP活性之间的谱效关系。在标定的12个共有峰中,确定了4、5、12号峰与ALP活性呈正相关,其对应的物质依次是咖啡酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、儿茶素7-葡糖苷、柚皮苷,为深入研究骨碎补的促成骨分化活性物质基础提供依据。

葡萄糖转运蛋白-1通过Wnt/β-catenin通路促进骨肉瘤MG63细胞迁移

目的:探讨葡萄糖转运蛋白-1(glucose transporter-1,Glut-1)通过Wnt/β-catenin通路促进骨肉瘤细胞MG63的迁移及其机制。方法:构建针对Glut-1基因的RNA干扰重组腺病毒(Ad-Glut-si RNA)及含对照序列的重组腺病毒(Ad-GFP),感染MG63细胞沉默Glut-1基因表达;通过Transwell小室法检测Blank组、Ad-AFP组、Ad-Glut-si RNA组、GSK-3抑制剂AZD2858组细胞的迁移能力;应用免疫荧光实验检测各组细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)的表达变化以及β-连环蛋白(β-catenin)的进核情况,通过Western blotting实验检测各组细胞的MMP-2、MMP-9表达变化以及Blank组、Ad-AFP组、Ad-Glut-si RNA组细胞FZD7、β-catenin、Dsh蛋白表达变化。结果:沉默Glut-1基因后,MG63细胞迁移能力明显下降(P<0.05);再给于AZD2858处理后,细胞的迁移能力恢复(P<0.05)。与Blank组和Ad-GFP组细胞相比,Ad-Glut-si RNA组MG63细胞E-cadherin表达显著升高(P<0.05),vimentin、MMP-2、MMP-9以及FZD7、β-catenin、Dsh蛋白表达显著降低(均P<0.05);与Ad-Glut-si RNA组相比,AZD2858组细胞E-cadherin表达显著降低(P<0.05),vimentin、MMP-2和MMP-9表达显著升高(P<0.05)。结论:Glut-1基因高表达与骨肉瘤MG63细胞侵袭转移具有密切联系,其可能机制在于Glut-1高表达后激活Wnt/β-catenin通路使EMT相关蛋白Ecadherin表达降低、vimentin以及MMP-2、MMP-9含量上升,从而促进MG63细胞的转移。

莪术醇诱导人骨肉瘤MG63细胞自噬的实验研究

目的观察莪术醇对人骨肉瘤MG-63细胞自噬性凋亡的作用。方法体外人骨肉瘤MG-63细胞单独或和莪术醇共同培养,MTT法检测莪术醇对骨肉瘤细胞系MG-63的增殖抑制作用;FITC-annexinⅤ/PI染色流式细胞术分析细胞凋亡;PI和hochest33258活细胞染色观察凋亡细胞核形态学变化;EGFP-LC3b细胞转染,荧光显微镜观察细胞自噬;微管相关蛋白1轻链3-β(LC3)蛋白和自噬相关蛋白Beclin-1表达水平用Western blotting方法分析。结果 MTT检测显示莪术醇可抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖,并具有浓度-时间依赖性;流式细胞术检测显示莪术醇可显著诱导MG-63细胞凋亡;活细胞荧光染色显示MG-63细胞核凝聚并碎裂成小体;细胞质内凝集荧光增强;LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值,Beclin-1蛋白表达明显增强;自噬抑制剂3-MA可明显逆转上述现象。结论莪术醇能明显抑制人骨肉瘤MG-63细胞的增殖,其机制主要是通过诱导自噬性凋亡。

KiSS-1抑制骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移

目的:探讨人肿瘤转移抑制基因KiSS-1对人骨肉瘤MG63细胞侵袭、迁移能力的影响。方法:构建KiSS-1表达质粒pSNAV2.0-KiSS-1。pSNAV2.0-KiSS-1质粒转染骨肉瘤MG63细胞,经G418筛选稳定表达KiSS-1基因的MG63细胞。应用real-time PCR、Western blotting检测KiSS-1 mRNA和蛋白的表达。Transwell小室法检测MG63细胞的侵袭力,millicell小室、细胞划痕愈合实验检测KiSS-1基因对MG63细胞迁移能力的影响。结果:成功建立pSNAV2.0-KiSS-1质粒并稳定转染MG63细胞(MG63-KiSS-1细胞),MG63-KiSS-1细胞高表达KiSS-1 mRNA和蛋白。转染KiSS-1质粒后的MG63细胞侵袭力显著降低(P<0.05);millicell法、细胞划痕愈合实验证实转染KiSS-1质粒后的MG63细胞迁移力也明显降低(P<0.05)。结论:KiSS-1基因能显著抑制人骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移能力,在骨肉瘤的转移中起重要作用。

三氧化二砷对骨肉瘤细胞株MG63／dox多药耐药的逆转作用及其机制

目的 探讨三氧化二砷（As2O3）对骨肉瘤阿霉素（ADM）耐药细胞株MG63/dox的逆转作用及其机制。方法 采用不同浓度ADM（1～1000 ng／ml）和As2O3（0.25～16 μmol／L）分别单独作用于MG63和MG63/dox细胞48 h，并选取2 μmol／L As2O3联合不同浓度ADM（1～1000 ng／ml）作用于MG63/dox细胞24、48、72 h，同时设不加任何药物处理的对照组。应用CCK-8法检测两种药物对MG63和MG63／dox细胞增殖的影响，流式细胞术检测2 μmol／L As2O3、200 ng／ml ADM单独或联合处理48 h后MG63／dox细胞的周期分布和凋亡率，蛋白免疫印迹法检测2 μmol／L As2O3、200 ng／ml ADM单独或联合处理48 h后MG63／dox细胞中P-gp、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果 As2O3和ADM单药作用于MG63/dox细胞48 h，细胞增殖均未受到影响；4、8、16 μmol/L As2O3和100、200、400、500、1000 ng/ml ADM分别作用于MG63细胞48 h，细胞增殖明显受到抑制（P＜0.05）。As2O3联合ADM抑制MG63／dox细胞增殖的作用明显高于ADM单药组和对照组（P＜0.05），且抑制作用呈时间依赖性。与对照组相比，两药联合处理组的细胞凋亡率升高，G0／G1期细胞比例降低，G2／M期细胞比例升高，以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。两药联合处理组MG63／dox细胞中Bax蛋白表达水平明显升高，而P-gp和Bcl-2蛋白表达水平明显降低，与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 As2O3联合ADM能够抑制骨肉瘤耐药细胞MG63／dox的增殖，这一作用可能与诱导细胞凋亡、上调Bax表达以及下调P-gp和Bcl-2表达有关。

巴戟天含药血清对人骨肉瘤MG63细胞凋亡及JNK信号通路的影响

目的观察巴戟天含药血清对人骨肉瘤MG63细胞凋亡的影响,并探讨其潜在机制。方法取4周龄SD大鼠12只,随机分4组,分别给予低、中、高三种浓度巴戟天溶液(0. 54、1. 08、2. 16 g/kg)及蒸馏水灌胃,分离血清。体外培养人骨肉瘤MG63细胞,采用不同浓度的巴戟天含药血清干预,以空白血清为对照。采用MTT法检测巴戟天含药血清干预MG63细胞24、48 h的增殖率,流式细胞术检测凋亡率,Hoechst 33258荧光染色法检测细胞凋亡形态,Western-blotting法检测JNK信号通路相关蛋白JNK、p-JNK、Bad、p-Bad、Cleaved caspase-3的表达情况。结果中、高浓度的巴戟天含药血清能有效抑制MG63细胞增殖(P <0. 01或P <0. 05),但干预48 h对比24 h并无显著差异;同时,高浓度组MG63细胞较对照组凋亡率显著增加(P <0. 01),细胞分布散乱,胞核固缩,细胞透亮,呈现典型的凋亡形态学特征;高浓度的巴戟天含药血清能显著增加MG63细胞JNK总蛋白及磷酸化p-JNK蛋白的表达(P <0. 01或P <0. 05),上调p-Bad和Cleaved caspase-3蛋白表达(P <0. 01),但对Bad总蛋白表达无明显影响。结论巴戟天含药血清能促进人骨肉瘤MG63细胞凋亡,其作用机制与激活JNK信号通路有关。

小檗碱和XAV939联合应用可抑制骨肉瘤细胞MG-63的迁移与凋亡

目的:探讨小檗碱(BBR)联合XAV939对骨肉瘤MG-63细胞迁移与凋亡的影响及其可能的机制。方法:培养MG-63细胞,分别加入20~120μmol/L的BBR和5~60μmol/L的XAV939,通过CCK-8法测定BBR和XAV939的细胞毒性,采用Chou-Talalay分析法计算两药的联合指数,确定后续实验的干预剂量;将MG-63细胞随机分为空白对照(NC)组、BBR组、XAV939组和BBR+XAV939联合组,采用划痕愈合实验、Transwell小室法检测BBR与XAV939单独或联合处理对MG-63细胞迁移能力的影响,Hoechst 33258染色、JC-1染色及AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测对细胞线粒体膜电位和凋亡的影响,免疫荧光法检测BAX蛋白的表达,WB法检测对细胞中MMP-2表达的影响,qPCR法检测对MMP-2基因表达的影响。结果:BBR和XAV939以剂量依赖方式抑制MG-63细胞的增殖,选定30μmol/L BBR、7.5μmol/L XAV939用于后续实验。与NC组相比,BBR(30μmol/L)、XAV939(7.5μmol/L)及BBR+XAV939联合处理细胞24 h后,MG-63细胞迁移能力显著降低、凋亡细胞显著增加(均P<0.05),线粒体膜电位下降(P<0.01),MMP-2的基因表达和MMP-2、BAX蛋白水平均降低(均P<0.05),并且,联合组的效应明显强于单药处理且(P<0.05或P<0.01)。结论:BBR和XAV939单独或联合应用可以抑制骨肉瘤MG-63细胞的迁移、促进凋亡,其机制可能与迁移相关蛋白MMP-2的表达降低,凋亡相关蛋白BAX的水平增加有关。

二氯乙酸钠对人骨肉瘤MG63细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的:观察二氯乙酸钠(sodium dichloroacetate,DCA-Na)对人骨肉瘤MG63细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法:将对数生长期的MG63细胞随机分为对照组和低、中、高浓度DCA-Na组,对照组不加DCA-Na,低、中、高DCA-Na组加入DCA-Na(终浓度分别为50μg·m L-1、100μg·m L-1、200μg·m L-1),并设1个只加等量培养基不加细胞和DCA-Na的空白组。分别在干预24 h、48 h、72 h后,采用Cell Counting Kit-8细胞活性检测试剂盒分光光度法检测MG63细胞增殖情况,测定光密度(optical density,OD),计算低、中、高DCA-Na组细胞增殖抑制率,细胞增殖抑制率=[1-(DCA-Na组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%;分别采用Caspase-3活性检测试剂盒分光光度法和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒流式细胞法检测MG63细胞Caspase-3酶活性情况和细胞凋亡情况;并在干预48 h后采用Transwell实验检测MG63细胞迁移情况。结果:1细胞增殖检测结果。干预后,低、中、高DCA-Na组MG63细胞增殖抑制明显,且随干预时间的延长,3组细胞增殖抑制率均呈上升趋势。各时间点间MG63细胞增殖抑制率差异有统计学意义(F=847.080,P=0.000),存在时间效应;干预24 h、48 h、72 h后,低、中、高DCA-Na组MG63细胞增殖抑制率的组间差异均有统计学意义,且低DCA-Na组<中DCA-Na组<高DCA-Na组[(10.802±3.000)%,(18.792±2.261)%,(27.080±3.133)%,F=2.795,P=0.000;(13.098±1.299)%,(25.215±2.676)%,(44.382±2.397)%,F=4.362,P=0.000;(14.728±1.177)%,(35.297±4.757)%,(64.227±4.549)%,F=5.896,P=0.000];3组间MG63细胞增殖抑制率总体比较,差异有统计学意义,存在分组效应(F=296.412,P=0.000);时间因素与分组因素之间存在交互效应(F=75.678,P=0.000)。2Caspase-3酶活性检测结果。对照组MG63细胞Caspase-3酶活性无明显变化,干预后低、中、高DCA-Na组MG63细胞Caspase-3酶活性均呈上升趋势。各时间点间MG63细胞Caspase-3酶活性的差异有统计学意义(F=1 480.792,P=0.000),存在时间效应;干预24 h、48 h、72 h后,4组间MG63细胞Caspase-3酶活性的差异均有统计学意义,且对照组<低DCA-Na组<中DCA-Na组<高DCA-Na组(0.027±0.003,0.143±0.005,0.153±0.008,0.161±0.003,F=2.320,P=0.000;0.035±0.003,0.174±0.004,0.184±0.007,0.253±0.001,F=1.014,P=0.000;0.031±0.004,0.246±0.006,0.275±0.003,0.371±0.004,F=1.000,P=0.000);4组间MG63细胞Caspase-3酶活性总体比较,差异有统计学意义,存在分组效应(F=624.975,P=0.000);时间因素与分组因素之间存在交互效应(F=94.579,P=0.000)。3流式细胞法细胞凋亡检测结果。对照组MG63细胞凋亡率无明显变化,干预后低、中、高浓度DCA-Na组MG63细胞凋亡率均呈上升趋势。各时间点间MG63细胞凋亡率的差异有统计学意义(F=359.645,P=0.000),存在时间效应;干预24 h、48 h、72 h后,各组间MG63细胞凋亡率的差异均有统计学意义,且对照组<低DCA-Na组<中DCA-Na组<高DCA-Na组[(2.554±0.427)%,(10.708±2.012)%,(20.857±2.531)%,(27.312±2.140)%,F=6.733,P=0.000;(1.748±0.202)%,(18.604±2.721)%,(29.471±1.605)%,(36.873±2.734)%,F=9.292,P=0.000;(1.944±0.112)%,(24.071±3.921)%,(30.050±3.921)%,(38.211±1.721)%,F=8.237,P=0.000];4组间MG63细胞凋亡率总体比较,差异有统计学意义,存在分组效应(F=46.627,P=0.000);时间因素与分组因素之间存在交互效应(F=7.012,P=0.000)。4细胞迁移检测结果。干预48 h后,4组迁移细胞数[显微镜每个视野下(×200)]的组间差异有统计学意义[(84.45±10.45)个,(74.56±9.45)个,(65.41±5.21)个,(40.21±4.52)个,F=148.243,P=0.000)];低、中、高DCA-Na组迁移细胞数均少于对照组(P=0.017,P=0.001,P=0.000),且低DCA-Na组>中DCA-Na组>高DCA-Na组(P=0.012,P=0.001,P=0.000)。结论:DCA-Na可抑制人骨肉瘤MG63细胞的增殖,增强MG63细胞Caspase-3酶活性,诱导和促进MG63细胞凋亡,抑制MG63细胞的迁移;且浓度越高、干预时间越长,其影响越明显。

沉默FOSL2基因对骨肉瘤MG63细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响

目的:探讨沉默FOS样抗原2(FOSL2)基因表达对骨肉瘤细胞生物学特性的影响及机制。方法:采用Western blot检测骨肉瘤和肉瘤旁正常组织中FOSL2蛋白的表达。取对数生长期MG63细胞分为空白对照组(加生理盐水)、阴性对照组(NC组,转染阴性对照siRNA)和FOSL2-siRNA组(转染FOSL2 siRNA),通过CCK-8、Annexin V-FITC/PI双染法及Transwell小室分别检测各组细胞增殖、凋亡情况和侵袭、迁移能力,Western blot检测FOSL2、PCNA、MMP-2和Bax蛋白表达,qRT-PCR检测PCNA、MMP-2和Bax mRNA表达。结果:FOSL2-siRNA组MG63细胞中FOSL2蛋白表达明显低于空白对照组和NC组(P<0.05)。与空白对照组和NC组比较,FOSL2-siRNA组细胞增殖明显降低,凋亡率明显升高,细胞侵袭和迁移能力明显降低,MMP-2和PCNA表达明显降低,Bax表达明显升高(P<0.05)。结论:沉默FOSL2基因表达可抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力,并诱导细胞凋亡,机制与下调PCNA和MMP-2表达,上调Bax表达有关。

不同浓度葡萄糖对人成骨肉瘤细胞株MG63活性的影响

目的观察不同浓度葡萄糖对体外培养的人成骨肉瘤细胞株MG63的影响,探讨糖尿病导致骨质疏松症可能的发病机制。方法采用4种不同浓度葡萄糖(5.5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L),培养基连续培养人成骨肉瘤细胞株MG63,观察葡萄糖对细胞增殖、分泌活性产物的能力、凋亡以及矿化能力等各个方面的影响。结果升高的葡萄糖浓度对细胞的增殖具有一定的促进作用,但增多的细胞数量并没有带来相应细胞活性的增加。相反,细胞分泌碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)的能力以及矿化能力不同程度的出现了下降,且在不考虑渗透压因素情况下,细胞凋亡比率增加。结论本实验证实了高糖环境对细胞活性,特别是矿化能力的抑制作用,为临床工作中严格控制血糖防止骨质疏松症的发生提供了理论依据。

骨肉瘤源外泌体通过Tim-3诱导巨噬细胞M2极化并促进MG63细胞的转移

目的:探究骨肉瘤来源的外泌体对肿瘤相关巨噬细胞分化的影响及其具体作用机制。方法:收集2018年3月至2019年10年于川北医学院附属医院骨科及小儿外科行骨肉瘤切除术、病理诊断明确的18例原发性骨肉瘤患者的肿瘤组织及癌旁组织,Western blotting实验检测Tim-3的表达水平;分离骨肉瘤MG63细胞外泌体(MG63-Exo),并采用透射电镜及纳米粒径分析进行鉴定,双荧光染色法验证其是否能够被巨噬细胞吞噬,利用qPCR检测MG63-Exo对巨噬细胞分化及IL-10、TGF-β、VEGF表达的影响,应用Transwell侵袭和迁移实验及Western blotting检测MG63-Exo所诱导分化的巨噬细胞对MG63细胞迁移及侵袭及EMT相关蛋白表达的影响;应用CRISPR/Cas9技术敲除MG63细胞中的Tim-3,Western blotting实验检测MG63-Exo中Tim-3表达,再次应用qPCR、Transwell及Western blotting实验检测来源于敲除Tim-3的MG63外泌体对巨噬细胞分化及其处理后的巨噬细胞对MG63的迁移、侵袭、EMT相关蛋白表达的影响;最后利用骨肉瘤肺转移小鼠模型验证上述不同来源的外泌体对骨肉瘤肺转移的影响。结果:透射电镜及纳米粒径分析结果证实成功分离了MG63-Exo,荧光共聚焦显微观察结果显示其能够被巨噬细胞吞噬。与对照组相比,MG63-Exo能够显著促进巨噬细胞的M2型分化(P<0.05);与对照组相比,经MG63-Exo诱导的M2巨噬细胞能够显著促进骨肉瘤细胞的迁移、侵袭与EMT能力(均P<0.05);应用CRISPR/Cas9技术敲除Tim-3后的MG63细胞中Tim-3 mRNA及蛋白表达均显著降低(P<0.05),且Tim-3能够以外泌体的形式转移至巨噬细胞中;与MG63-Exo共培养的巨噬细胞相比,来源于Tim-3敲除细胞的MG63-Exo能显著抑制巨噬细胞的M2型分化(P<0.05);相比与经MG63-Exo诱导的巨噬细胞进行共培养的MG63细胞,Tim-3敲除的MG63-Exo诱导的巨噬细胞能显著抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭与EMT及促进肿瘤肺转移(均P<0.05)。结论:骨肉瘤来源的外泌体通过Tim-3诱导巨噬细胞的M2极化并促进肿瘤的侵袭及转移能力。

甘草次酸抑制骨肉瘤细胞MG63增殖的NF-κB信号通路机制

目的:探讨甘草次酸抑制骨肉瘤细胞MG63增殖的机制。方法:实验应用骨肉瘤细胞MG63作为研究对象,分5组。空白组、甘草次数组(50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L)、阳性对照组。每组6个复孔。空白组为不含有甘草次酸的DMEM的培养基,甘草次酸组分别加入50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L的甘草次酸,阳性对照组加入白藜芦醇(40μmol/L)。将细胞接种于培养瓶内,当细胞进入生长平台期后使用0.1%的胰酶消化并按1×106 cells/ml的密度接种于96孔板中,继续培养24 h。采用甲基四氮唑蓝检测细胞的增长率,Annexin V/PI双标记流式细胞术检测骨肉瘤细胞MG63的凋亡,蛋白质印迹法检测NF-κB蛋白的表达。结果:与空白对照组相比,甘草次酸孵育24 h后,各组的骨肉瘤细胞G63增殖率明显降低(P<0.05)、凋亡细胞比例明显升高(P<0.05);甘草次酸孵育48 h后,骨肉瘤细胞G63增殖率和NF-κB蛋白的相对表达量均明显降低(P<0.05)、凋亡细胞比例明显升高(P<0.05)。与阳性对照组比较,甘草次酸孵育24 h后,50μmol/L甘草次酸组的细胞增殖率显著增高、100μmol/L和200μmol/L甘草次酸组的骨肉瘤细胞的增殖率显著降低(P<0.05),甘草次酸孵育48 h后,50μmol/L组和100μmol/L组骨肉瘤细胞的增殖率显著升高,而200μmol/组显著降低(P<0.05);甘草次酸孵育24 h后,50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L组的骨肉瘤细胞的凋亡率均显著降低(P<0.05);而甘草次酸孵育48 h后,50μmol/L、100μmol/L组的骨肉瘤细胞的凋亡率也显著降低,而200μmol/L组的凋亡率则显著升高。各剂量组间比较,200μmol/L甘草次酸组的效果最佳,差异有显著性(P<0.05);孵育48 h后,200μmol/L甘草次酸组的效果无论在骨肉瘤细胞的增殖率还是凋亡比例其效果均优于阳性对照组(P<0.05)。结论:甘草次酸对骨肉瘤细胞G63增殖有抑制作用,其机制可能通过影响NF-κB信号通路,达到抑制骨肉瘤细胞MG63增殖的作用。

外源性BMP9对骨肉瘤细胞MG63的影响与Wnt/β-catenin信号通路的关系

目的研究外源性骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)过表达对骨肉瘤细胞的影响与Wnt/β-catenin信号通路的关系。方法用携带人BMP9基因的重组腺病毒Ad BMP9转染人骨肉瘤细胞MG63,上调MG63中BMP9的表达水平;MTT法检测细胞增殖能力的变化,Hochest染色法检测细胞凋亡的变化,Transwell实验检测细胞迁移能力的变化;实时定量PCR和Western blot分别检测Wnt/β-catenin信号通路中相关分子β-catenin、c-myc、cyclin D1和E-cadherin在mRNA和蛋白水平表达的变化。统计分析实验结果。结果获得了过表达BMP9的MG63细胞;BMP9能促进MG63细胞的增殖、迁移和凋亡;MG63细胞中BMP9的过表达增强了Wnt/β-catenin信号通路中相关分子β-catenin、c-myc、cyclin D1的表达,减弱了E-cadherin的表达。结论 BMP9对于骨肉瘤细胞MG63具有正性调节作用,该调控作用可能与Wnt/β-catenin信号通路相关。

绿原酸对人骨肉瘤MG63细胞生物学行为的影响

目的:探讨绿原酸对人骨肉瘤MG63细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响。方法:采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖,细胞侵袭实验(Transwell)及细胞划痕实验检测细胞侵袭性及迁移性,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞干性基因及凋亡相关基因,凋亡试剂盒检测细胞凋亡比例。结果:在100μg/mL绿原酸干预的实验组中MG63细胞增殖减慢,细胞干性基因较对照组表达降低,侵袭性及迁移性经绿原酸处理后也相应降低,抗凋亡基因Bcl-2表达下降,细胞凋亡比例增加。结论:绿原酸对MG63人骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移具有抑制作用并促进MG63细胞的凋亡,有望成为治疗骨肉瘤的有效药物。

下调miR-19b表达对骨肉瘤MG63细胞侵袭、迁移及Wnt/β-Catenin通路的影响

目的:探讨下调miR-19b表达对骨肉瘤MG63细胞侵袭、迁移能力的影响,并探讨可能机制。方法:采用脂质体转染法转染人骨肉瘤MG63细胞,实验分为空白组、miR-19b inhibitor NC组、miR-19b inhibitor组,采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞增殖情况,通过Transwell小室法检测各组细胞侵袭、迁移情况,通过免疫印迹(WB)法检测侵袭、迁移以及Wnt/β-连环蛋白(β-Catenin)通路相关蛋白表达情况。结果:与空白组、miR-19b inhibitor NC组相比,miR-19b inhibitor组miR-19b相对表达量、转染后48 h、72 h吸光度(A)值、侵袭与迁移细胞数、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、Wnt、细胞核β-Catenin表达水平显著降低(P<0.05),细胞质β-Catenin表达水平显著升高(P<0.05)。结论:下调miR-19b表达可能通过抑制Wnt/β-Catenin信号通路激活,从而抑制骨肉瘤MG63细胞侵袭、迁移。

靶向SOX4基因的慢病毒感染对骨肉瘤MG63细胞凋亡的影响

目的:探讨靶向SOX4基因的慢病毒感染对骨肉瘤细胞凋亡的影响。方法:体外培养人成骨细胞株h FOB1. 19和骨肉瘤细胞株MG63,采用qRT-PCR和Western blot检测两种细胞中SOX4 mRNA和蛋白的表达。将MG63细胞分为对照组、阴性组(感染LV-NC-GFP-shRNA)、干扰组(感染LV-SOX4-GFP-shRNA)和干扰+抑制剂组(LV-SOX4-GFP-shRNA感染前加Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO),采用qRT-PCR和Western blot检测对照组、阴性组和干扰组MG63细胞SOX4 mRNA和蛋白的表达情况,用于判断慢病毒感染效果;采用流式细胞仪检测4组细胞凋亡,Western blot检测酶切Caspase-3蛋白的表达,Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3活性,采用JC-1染色检测线粒体膜电位。结果:与h FOB1. 19细胞相比,MG63细胞中SOX4 mRNA和蛋白的表达水平升高(P <0. 05);与对照组相比,干扰组MG63细胞中SOX4 mRNA和蛋白的表达降低。干扰组较对照组细胞凋亡增加、Caspase-3活性和酶切蛋白的表达增强,线粒体膜电位降低(P均<0. 05),而干扰+抑制剂组上述变化减弱(P <0. 05)。结论:SOX4促进MG63细胞凋亡的作用机制可能与Caspase-3介导的凋亡途径有关。

沉默H19对骨肉瘤细胞系MG63增殖、侵袭的影响

目的:研究长链非编码RNA H19对骨肉瘤MG63细胞增殖、侵袭的影响。方法:RNA干涉技术沉默MG63细胞中H19,荧光实时定量PCR(RT-q PCR)检测骨肉瘤MG63细胞中H19的表达情况;流式细胞术检测细胞周期的变化;MTT实验检测沉默H19表达对细胞增殖的影响;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果:H19-siRNA可有效沉默H19在骨肉瘤细胞MG63中的表达,沉默MG63细胞中H19的表达可以明显抑制骨肉瘤细胞的细胞周期,降低骨肉瘤细胞的增殖、侵袭能力。结论:H19在骨肉瘤的发生发展及侵袭中发挥重要作用。

miR-185通过靶向调控CDC42基因表达抑制骨肉瘤MG63细胞的增殖和迁移

目的:分析miR-185以及细胞分裂周期蛋白42(CDC42)在骨肉瘤组织和细胞中的表达情况,初步探究miR-185是否通过调控CDC42影响骨肉瘤MG63细胞的增殖与迁移。方法:选取2020年1月至2021年1月于衡水市第四人民医院经病理确诊为骨肉瘤的的28例患者的癌组织及癌旁组织,采用免疫组化法检测骨肉瘤组织中CDC42的表达,采用qPCR法检测骨肉瘤组织中miR-185的表达。双荧光素酶报告基因实验验证CDC42基因与miR-185间的靶向关系。根据转染物不同,将MG63细胞分为miR-185 mimic组、miR-NC组、miR-185 inhibitor组、NC-inhibitor组、CDC42组(转染CDC42过表达载体)及阴性对照(NC)组,采用划痕愈合实验、CCK-8法和流式细胞术分别检测miR-185和CDC42表达对MG63细胞迁移、增殖和周期的影响。构建骨肉瘤MG63细胞裸鼠移植瘤模型,采用免疫组化法、qPCR法和WB法检测过表达或敲降miR-185对移植瘤组织中Ki67与CDC42表达的影响。结果:与癌旁组织相比,骨肉瘤组织中miR-185表达明显降低,而CDC42表达显著升高(均P<0.01)。CDC42是miR-185的靶基因。与对照组相比,miR-185 mimic组MG63细胞的迁移和增殖能力均受到抑制(均P<0.01),而CDC42组MG63细胞的迁移和增殖能力均升高、细胞周期阻滞于S期(均P<0.01);与miR-185组相比,miR-185+CDC42组MG63细胞的迁移和增殖能力均升高、S期细胞比例升高(均P<0.01)。与对照组相比,miR-185 mimic组移植瘤组织中Ki67、CDC42表达均显著降低(均P<0.01),而miR-185 inhibitor组则相反(均P<0.01)。结论:在骨肉瘤组织中,miR-185呈低表达而CDC42呈高表达,miR-185能够通过负调控CDC42的表达,从而抑制骨肉瘤MG63细胞的增殖和迁移。

虫草素对人骨肉瘤细胞株MG63增殖及凋亡的影响

目的研究不同浓度虫草素对人骨肉瘤细胞株MG63增殖与凋亡的影响。方法不同浓度虫草素作用于MG63细胞48 h后,倒置显微镜观察细胞形态变化,MTS法检测虫草素对MG63细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测虫草素对MG63细胞周期和凋亡的作用,Hoechst 33342染色和Western blot检测虫草素对骨肉瘤细胞凋亡的影响。结果虫草素对人骨肉瘤细胞增殖有显著抑制作用,且呈浓度和时间依赖性。流式细胞术结果显示该细胞被阻滞在S期和G_2/M期(P<0.05),同时虫草素可引起MG63细胞早期凋亡(P<0.05)。Western blot结果显示,随虫草素浓度增加,Bcl-2蛋白表达下调,而Bax蛋白表达上调,且各实验组均出现蛋白分子量为89 k D的PARP裂解条带。结论虫草素通过下调MG63细胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2并上调促凋亡蛋白Bax表达,同时阻滞细胞周期进展,促进早期凋亡。