OtsAB途径对谷氨酸棒杆菌ATCC 13032胞内海藻糖含量及细胞耐受性的影响

OtsAB途径是谷氨酸棒杆菌胞内海藻糖3条合成途径中最主要的一条．从野生型谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032出发，通过重叠延伸PCR及同源重组技术构建了OtsAB途径缺陷突变株Corynebacterium glutamicum（AotsAB）；利用谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pEC—XK99E构建重组工程菌株Corynebacterium glutamicum（pECotsAB）过量表达同源otsA及otsB基因．考察了野生型、缺陷型及过量表达菌株对于不同渗透压和培养温度的耐受性及该条件下各菌株胞内海藻糖的含量．结果表明：不同培养条件下，Corynebacterium glutamicum（AotsAB）胞内海藻糖含量与同条件野生型相比减少了34．40％～44．96％，对于渗透压和温度的耐受性明显降低；在相同的培养温度（30℃）、不同的渗透压条件下，Corynebacterium glutami．cum（pECotsAB）胞内海藻糖含量与野生型相比增加了14．53％～34．5％；细胞对于温度和渗透压的耐受性随胞内海藻糖含量的增加而提高．

以纤维二糖为底物利用重组大肠杆菌合成海藻糖

探讨以纤维二糖为底物合成海藻糖的可行性。首先克隆来自施氏假单胞菌A1501的otsA/otsB基因,外源导入Escherichia coli BL21(DE3)构建以葡萄糖为底物合成海藻糖的OtsAB途径。继而通过过表达E. coli本身的galU基因增加海藻糖合成前体物质尿苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖的含量,使海藻糖产量提高了3倍。通过添加井冈霉素抑制海藻糖的降解,进一步提高海藻糖的产量。在此基础上,过表达来自天然纤维素分解细菌Saccharophagusdegradans的纤维二糖磷酸化酶基因cepA,使重组大肠杆菌具有利用纤维二糖产海藻糖的能力。利用该重组大肠杆菌全细胞催化生产海藻糖,底物为20 g/L纤维二糖,并添加0.05 mmol/L的井冈霉素抑制海藻糖降解时,48 h后可生成1.3 g/L的海藻糖。本研究利用重组大肠杆菌以纤维二糖为底物合成海藻糖,证实了以纤维二糖为底物合成海藻糖的可行性,为纤维二糖来源精细化学品的生产提供了新的思路。