禽大肠杆菌外膜蛋白基因C(ompC)的序列分析

根据 Gen Bank中人源大肠杆菌 K- 12外膜蛋白基因 C(omp C)的核苷酸序列设计引物 ,应用 PCR方法从禽大肠杆菌 O2 、O78株及它们的融合双价弱毒菌株 O2 ,78(Norr Chlr)中分别扩增得到 omp C基因 ,序列测定及分析比较发现 ,3个菌株的 om p C基因均由 170 2 nt组成 ,核苷酸序列完全相同 ,只有 1个大的开放性阅读框 (ORF) ,长 10 92 bp,编码由 36 3个氨基酸组成的前 Om p C蛋白 ,前 2 1个氨基酸残基组成信号肽 ,成熟的 Omp C蛋白由 342个氨基酸残基组成 ,Mr为 4 0 0 0 0。其氨基酸序列也完全相同。从基因水平上证明了禽大肠杆菌 O2 、O78株及融合双价弱毒菌株 O2 ,78(NorrChlr)存在相同的外膜蛋白 C抗原 ,从而为进一步研究 Omp

以CotB为分子载体表面展示鸡白痢沙门氏菌OmpC的重组枯草杆菌芽孢对小鼠免疫效果的研究

为研究小鼠口服以CotB为分子载体表面展示鸡白痢沙门氏菌外膜蛋白OmpC的重组枯草杆菌芽孢后诱导产生的特异性抗体水平与交叉保护作用,本研究将120只成年雌性小鼠随机分为5组,A组与B组在第0、15 d分别灌服重组枯草杆菌SE1与野生型枯草杆菌168芽孢(1.0×10^(10)cfu芽孢/次/只),C组与D组则分别拌料饲喂重组枯草杆菌SE1与野生型枯草杆菌168芽孢(1.0×10~6cfu芽孢/g饲料),E组仅饲喂基础日粮。饲喂至22d,每组随机选取4只小鼠采集血清和小肠内容物,采用ELISA检测各组小鼠OmpC特异性抗体水平;同时,每组小鼠随机选取16只并分为两个小组,进行鼠伤寒沙门氏菌交叉保护试验。结果显示,口服重组芽孢可诱导产生特异性血清IgG与肠粘膜SIgA抗体,与对照组相比差异极显著(p<0.01),拌料饲喂方式所诱导的抗体水平均显著高于灌服方式(p<0.05);重组芽孢可为小鼠抗2×LD_(50)和10×LD_(50)攻毒剂量的鼠伤寒沙门氏菌感染提供100%和50%的保护作用。结果表明,重组芽孢经口服免疫可诱导机体产生特异性血清IgG与肠粘膜SIgA抗体,并可赋予交叉保护作用抗鼠伤寒沙门氏菌感染。

产CTX-M-55-like型β-内酰胺酶同时伴膜孔蛋白ompC基因新突变等多株大肠埃希菌新菌株的发现

目的:调查大肠埃希菌(Escherichia coli,ECO)尿液分离株中β-内酰胺酶和膜孔蛋白ompC基因的存在和变异情况。方法:收集南京医科大学第一附属医院2006年1月～2008年10月患者尿液标本中分离到的ECO菌共60株,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析21种β-内酰胺酶基因和膜孔蛋白ompC基因。结果:在60株ECO菌中,TEM基因阳性51株(85.0%),经测序比对均为TEM-1-like;OXA-1群基因阳性6株(10.0%),经测序比对均为OXA-30-like;CTX-M-1群基因阳性38株(63.3%),经测序比对均为CTX-M-55-like。膜孔蛋白ompC基因经测序比对60株中有6株(10.0%)无突变,其余54株均有突变(突变率90.0%),其中6株经BLASTn比对确认为新的突变类型。结论:产CTX-M-55-like型β-内酰胺酶和膜孔蛋白ompC基因是本组ECO菌对β-酰胺类抗菌药物产生耐药的重要原因。6株ompC基因新的突变类型中,3株为同时携带TEM-1-like、CTX-M-55-like基因的新菌株;2株为携带了TEM-1-like基因的新菌株;1株为同时携带了TEM-1-like、OXA-30-like基因的新菌株。

艾灸对钩端螺旋体感染豚鼠延髓中c-fos表达的影响

选用３９ＫＤａ的钩端螺旋体外膜蛋白（ＯｍｐＬ３９）免疫豚鼠并施予艾灸，研究艾灸对伤害性刺激所致延髓中枢原癌基因ｃｆｏｓ表达的影响。结果表明：灸加ＯｍｐＬ３９、单用ＯｍｐＬ３９和单纯艾灸均能使豚鼠体内出血程度减轻，抑制内部伤害所致ｃｆｏｓ表达的中枢积累，且灸加ＯｍｐＬ３９组作用最强，单用ＯｍｐＬ３９组次之，单纯艾灸组再次之。提示艾灸通过扶助正气，减轻了钩体在体内造成的病理伤害和伤害性刺激的传入，从而使原癌基因ｃｆｏｓ在中枢的表达减少，促进了ＯｍｐＬ３９的免疫保护力。

老年冠心病患者GDF-15、hs-CRP的表达及与心脏外膜脂肪厚度的相关性分析

目的探讨老年冠心病患者生长分化因子15(growth differentiation factor-15,GDF-15)、超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)的表达及与心脏外膜脂肪厚度的相关性。方法选择2019年2月至2021年2月我院接诊的124例老年冠心病患者为本研究对象,设为病例组,并选择我院同期体检健康人群100例作为对照组,分析血清GDF-15、hs-CRP、心脏外膜脂肪厚度、心外膜脂肪CT值水平变化情况,及其之间的相关性分析。结果病例组患者血清GDF-15、hs-CRP、心脏外膜脂肪厚度、心外膜脂肪CT值水平显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);单支病变患者血清GDF-15、hs-CRP、心脏外膜脂肪厚度、心外膜脂肪CT值水平显著低于双支病变、三支病变患者,双支病变患者血清GDF-15、hs-CRP、心脏外膜脂肪厚度、心外膜脂肪CT值水平显著低于三支病变患者,差异具有统计学意义(P<0.05);相关性分析结果中显示,GDF-15、hs-CRP和心脏外膜脂肪厚度、心外膜脂肪CT值之间均呈正相关(P<0.05)。结论在老年冠心病患者中血清GDF-15、hs-CRP的表达和心脏外膜脂肪厚度之间存在着密切关系,可用于准确评价冠状动脉病变严重程度。

C群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NhhA重组载体pASK-IBA37plus-nhhA的构建

构建C群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白Nhh A重组载体p ASK-IBA37plus-nhh A。以脑膜炎奈瑟菌C群菌株为实验材料,根据Gene Bank上的已知序列设计引物,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增C群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白Nhh A基因(nhh A)。将nhh A与p ASK-IBA37 plus质粒用EcoRI,Xho I进行双酶切并尝试不同条件进行连接;连接产物实现在大肠杆菌TOP10感受态细胞中的转化。使用验证质粒图谱初筛和PCR与EcoRI,Xho I双酶切双重验证法复筛的方式筛选p ASKIBA37plus-nhh A阳性转化子。最后将构建好的p ASK-IBA37plus-nhh A进行基因测序。成功构建C群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白Nhh A重组载体p ASK-IBA37plus-nhh A,同时发现nhh A与p ASK-IBA37plus摩尔数之比为5.1、连接体系20μL、DNA终浓度为1.7 ng/μL时,获得的转化子阳性率能达到18.8%,且转化子菌落总数数量适中,方便后续筛检。同时,测序得到1 797 bp的nhh A序列信息,在Gen Bank上进行序列相似性比对,发现该基因与脑膜炎奈瑟菌NGH38的外膜蛋白GNA992(Neisseria meningitidis strain NGH38 outer membrane protein GNA992)基因的相似性为98%。

E型沙眼衣原体MOMP基因重组腺病毒的构建及免疫原性研究

目的:构建E型沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)基因重组腺病毒,为沙眼衣原体腺病毒疫苗的研究奠定基础。方法:根据Genebank中E型Ct MOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到MOMP基因片段,克隆至pcDNAII载体,测序后连接入腺病毒穿梭载体pDC316。穿梭载体pDC316-MOMP与含腺病毒基因组的辅助质粒PBHGlox△E1,3Cre共转染至HEK293细胞,在Cre-loxP重组酶作用下进行重组,包装成重组腺病毒颗粒,用PCR和RT-PCR方法进行鉴定。并用动物免疫试验检测重组腺病毒的免疫原性。结果:从E型Ct基因组DNA中扩增出约1.1 kb的特异MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实穿梭载体pDC316-MOMP构建正确。穿梭载体pDC316-MOMP与含腺病毒基因组的辅助质粒PBHGlox△E1,3Cre共转染至293细胞,出现明显细胞病变效应。收集重组腺病毒,PCR法证实重组腺病毒含有MOMP基因,RT-PCR证实重组腺病毒在293细胞能表达MOMP基因。重组腺病毒免疫小鼠可诱导特异性抗体产生,证明重组腺病毒具有良好免疫原性。结论:成功构建了E型沙眼衣原体MOMP基因重组腺病毒,该重组腺病毒可诱导小鼠产生特异性抗体。

外膜蛋白OmpC在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及重组活菌制剂在肉鸡上的应用

为了研究携带鸡白痢沙门菌主要外膜蛋白OmpC基因的重组枯草芽孢杆菌活菌制剂在肉鸡上的免疫原性,以具有益生菌属性的枯草芽孢杆菌作为基因疫苗表达宿主,构建表达鸡白痢沙门菌主要外膜蛋白的枯草芽孢杆菌重组菌(pHT43/WB800n-OmpC)。将重组菌饮水饲喂12日龄艾维茵肉鸡,同时设空白、空转菌及非诱导菌对照组,分别于免疫后27和42日龄测定特异性抗体效价,同时45日龄后采用沙门菌C79-13株腹腔注射攻毒。结果:SDS-PAGE分析显示该重组蛋白大小为37 ku;Western blot分析显示表达蛋白具有很好的反应原性;肉鸡饲喂结果显示,42日龄时血清中检测到特异性抗体,且抗体效价为1∶32;攻毒试验显示重组菌诱导组免疫保护率为76.92%,而对照组、空转菌组、非诱导组保护率分别为23.08%、38.46%和30.77%。结果表明:此重组菌对鸡沙门菌具有免疫保护作用,为沙门菌的免疫机制研究奠定了基础,同时实现了饲用疫苗的双重作用。

蛋白质跨线粒体膜运送的研究进展

线粒体拥有约1000种蛋白质,其中98%以上系由细胞核编码,在细胞质核糖体上以前体形式合成,之后再运至线粒体,经跨膜运送并分选定位于各部分。现对定位于外膜、基质和内膜的蛋白质的运送途径的研究进展作一扼要介绍。脱血红素细胞色素c是细胞色素c的前体,它不含导肽,对其转运的研究概况也作了评述。

外膜蛋白C作为蛋白呈递平台将抗原定位至细菌外膜囊泡表面的可行性

目的探讨外膜蛋白C(outer membrane protein C,OmpC)作为蛋白呈递平台将抗原定位至细菌外膜囊泡(outer membrane vesicle,OMV)表面的可行性。方法构建含有ompC基因片段及金黄色葡萄球菌EsxA抗原基因(esxA基因)的重组表达质粒,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行12%SDS-PAGE分析。提取重组菌OMV,经12%SDS-PAGE分析OMV总蛋白,并采用Western blot法和纳米流式仪检测融合蛋白定位至OMV表面的情况。结果含ompC基因和esxA基因的重组表达质粒经测序证明构建正确。融合蛋白OmpC-EsxA经12%SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约57000的目的蛋白条带,大小与预期相符。OMV总蛋白经12%SDS-PAGE分析,可见多条蛋白条带,表明成功提取重组菌OMV。重组菌OMV表面的融合蛋白OmpC-EsxA可与小鼠抗His-Tag抗体发生特异性结合,且纳米流式仪可检测到荧光抗体标记的OMV。结论OmpC可作为蛋白呈递平台将抗原定位至OMV表面,有望应用于抗原呈递疫苗的研发。

B群脑膜炎球菌外膜蛋白偶联A+C群脑膜炎球菌结合疫苗的免疫原性研究

目的了解B群脑膜炎球菌外膜蛋白(Group B Meningococcal Outer Membrane Protein,MenB-OMP)偶联A+C群脑膜炎球菌结合疫苗(Meningococcus Group A and Group C Conjugate Vaccine,MCVA+C)的免疫原性。方法按2:1比例随机双盲对照试验设计原则,观察3～5月龄、6～23月龄、2～6岁、7～24岁四个年龄组,检测免疫前、后A、B、C群血清杀菌抗体(Serum Bactericidal Antibody,SBA)。结果观察疫苗对不同年龄组免疫前、后A、B、C群SBA同时≥4倍增长率为97.65%～100%,SBA同时≥1:128的占88.89%～96.47%,几何平均滴度为1:194～1:420,与对照组相比差异有统计学意义。结论MenB-OMP偶联MCVA+C有良好的免疫原性。

鸡白痢沙门菌外膜蛋白C的原核表达与免疫反应性分析

利用PCR方法扩增鸡白痢沙门菌主要抗原外膜蛋白C的基因,将其定向克隆至pET30a(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21表达菌,利用His标签的蛋白纯化柱纯化重组蛋白,通过免疫印迹检测重组蛋白活性。通过BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定获得了pET30a-C原核表达重组质粒,转化BL21表达菌后,通过IPTG诱导获得以包涵体形式存在的重组蛋白,重组蛋白纯化后免疫印迹检测显示具有良好的反应原性。本研究为鸡白痢基因工程抗原的制备及诊断试剂研究奠定了基础。

耐药大肠埃希菌β-内酰胺酶基因及膜孔蛋白基因研究

目的调查大肠埃希菌中β-内酰胺酶基因和膜孔蛋白ompC基因的存在及变异情况。方法收集医院2009年6月-2010年6月临床分离的耐药大肠埃希菌共20株,采用聚合酶链反应(PCR),分析A、B、C、D等4类β-内酰胺酶24种基因和膜孔蛋白ompC基因。结果 20株耐药大肠埃希菌共检出TEM、CTX-M-1群和OXA-1群等3种β-内酰胺酶基因,阳性率分别为45.0%、40.0%和10.0%,其余21种基因均未检出;20株耐药大肠埃希菌共检测到19株占95.0%,膜孔蛋白编码基因ompC,经测序比对除11号株外,其余18株占90.0%均存在突变。结论 20株耐药大肠埃希菌对β-内酰胺类药物耐药为产β-内酰胺酶和膜孔蛋白变异的共同结果。

血清抗微生物抗体检测对炎症性肠病诊断的临床意义

目的：探讨抗酿酒酵母抗体（ASCA）、大肠埃希菌外膜孔道蛋白 C 抗体（anti-Omp C）、荧光假单胞菌相关序列 I2抗体（anti-I2）、细菌鞭毛蛋白抗体（anti-CBirl）在 IBD 诊治中的临床意义。方法收集2011年至2013年 IBD 患者87例，分为 CD 组、UC 组，其中 CD 组66例，UC 组21例，并根据IBD 患者的年龄及男女比例收集健康对照组62名。空腹采集受试者静脉血2 mL，使用 ELISA 试剂盒检测血清中的 ASCA，anti-OmpC，anti-I2和 anti-CBirl 4种抗微生物抗体的表达。分别绘制 ROC 曲线比较各抗体对 IBD，以及 UC 与 CD 的诊断和鉴别诊断意义。结果ASCA 在区分 IBD 与健康对照组、CD 组与 UC 组的 AUC 分别为0．580，0．512，有较低的诊断准确性。anti-CBirl 在区分 IBD 与健康对照组的 AUC 为0．617，其余血清抗体在各组间比较无鉴别诊断意义。ASCA 在 IBD 组的阳性率分别为62．1％（54/87），显著高于健康对照组的38．7％（24/62）。anti-OmpC，anti-I2在 IBD 组的阳性率显著低于健康对照组，差异均有统计学意义（P 均＜0．05），其余各对比组间血清抗体的阳性率差异均无统计学意义（P 均＞0．05）。ASCA 阳性鉴别 CD 与 UC 的特异度、敏感度、阳性预测值和阴性预测值分别为52．4％、66．7％、81．48％、33．33％，anti-OmpC，anti-I2和 anti-CBirl 鉴别 CD 和 UC 的特异度在81．0％～100．0％，敏感度在9．1％～37．9％。联合 ASCA 阳性或 anti-I2阳性诊断 CD 的特异度、敏感度、阳性预测值和阴性预测值分别为57．1％、86．4％、82．6％、50．0％。CD 患者中 ASCA 或 anti-I2的阳性率显著高于 UC 组[84．8％（56/66）比57．1％（12/21）]，差异有统计学意义（χ2＝5．633，P ＝0．018）。结论ASCA 阳性对于中国 IBD 患者的检测有一定意义，检测 anti-I2可用于 ASCA 阴性 CD 患者的辅助诊断。anti-OmpC和 anti-CBirl 由于敏感度和阳性率均较低，对于国人诊断 IBD，以及鉴别 UC 和 CD 意义不大。