卵巢癌细胞系SKOV3冻融抗原诱导CTL特异性杀瘤效应的研究

目的探讨卵巢癌冻融抗原对T淋巴细胞的增殖作用及其诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在体外杀伤卵巢癌细胞的抗原特异性细胞毒性效应。方法采用免疫磁珠分离法(magneticactivatedcellsorting,MACS)分离纯化正常人外周血CD+3T细胞,体外以SKOV3卵巢癌细胞中提取的可溶性肿瘤抗原加以刺激。溴标法检测肿瘤抗原对T细胞增殖的影响;MTT法测定肿瘤抗原诱导的CTL体外杀伤卵巢癌细胞的能力;利用绒毛膜癌细胞抗原对比观察肿瘤抗原诱导CTL杀伤肿瘤细胞的抗原特异性。结果卵巢癌细胞抗原有很强的促进T淋巴细胞增殖的作用,且存在时间依赖性,在24h时促进作用最强。SKOV3抗原诱导的CTL在体外对SKOV3细胞的杀伤率为68.38%,显著高于它对JAR绒毛膜癌细胞的杀伤率(18.31%);而JAR细胞抗原诱导的CTL对JAR和SKOV3细胞的杀伤率分别为61.02%和14.79%,有显著的抗原特异性(P=0.0001)。结论卵巢癌细胞冻融抗原诱导的CTL在体外具有很强的增殖能力和抗原特异性杀伤卵巢癌细胞的作用。

建立卵泡刺激素受体单位点基因突变体的卵巢癌SKOV3细胞和裸鼠模型

目的建立转染卵泡刺激素受体(FSHR)307和680位点突变的上皮性卵巢癌SKOV3细胞系和裸鼠动物模型。方法将人卵巢颗粒细胞(来自体外受精取卵时废弃的颗粒细胞),行原代培养后用于FSHR RNA提取;FSHR和FSHR307、680位点突变重组蛋白构建;将FSHR和FSHR307、680位点突变蛋白转染SKOV3细胞株;将处理后的3组SKOV3细胞接种到裸鼠皮下,8周后处死裸鼠,并取瘤组织验证。结果建立了307和680位点突变的FSH受体高表达的上皮性卵巢癌SKOV3细胞系和裸鼠动物模型。结论成功地建立了307和680位点突变的FSH受体高表达的SKOV3上皮性卵巢癌细胞系和裸鼠移植瘤模型,为FSH在上皮性卵巢癌中的作用和治疗提供了一种新的细胞模型和动物模型。

体外靶向PI3K基因RNA干扰对卵巢癌SKOV3细胞Akt表达的影响

目的采用RNA干扰技术沉默卵巢癌SKOV3细胞中PI3K/Akt信号转导通路中关键基因PI3Kp110α,观察其对PI3K/Akt信号通路下游信号蛋白Akt的影响,以期为卵巢癌的基因治疗提供可靠的理论依据。方法体外培养人卵巢癌SKOV3细胞,脂质体介导靶向P13Kp110α基因的小干扰RNA(siRNA)转染卵巢癌SKOV3细胞,采用荧光定量PCR法检测干扰后PI3K、Akt mRNA的表达,免疫荧光双标法观察RNA干扰48 h后对PI3K、Akt蛋白的影响。结果 Real-time PCR结果示RNA干扰组PI3K、Akt mRNA相对含量显著低于空白载体组和对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而空白载体组与对照组表达差异无统计学意义(P>0.05);免疫荧光细胞化学结果示RNA干扰组的PI3K、Akt蛋白阳性率较对照组与空白载体组明显减少,而对照组与空白载体组比较无明显差异。结论 siRNA可沉默卵巢癌SKOV3细胞P13Kp110α基因的表达,同时减轻PI3K蛋白及下游信号蛋白Akt的表达,以PI3Kp110α为靶点的RNA干扰技术可望成为卵巢癌基因治疗的新策略。

香菇多糖对卵巢癌细胞株SKOV3增殖及其裸鼠移植瘤生长抑制作用的研究

目的:研究香菇多糖(LNT)对卵巢癌细胞株SKOV3增殖及其裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法:LNT与卵巢癌细胞株SKOV3共同体外培养,绘制细胞生长曲线,观察LNT对卵巢癌细胞株SKOV3生长的影响;建立卵巢癌皮下移植瘤动物模型,采用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色,观察LNT对移植瘤的生长抑制作用,并利用新生血管计数实验检测LNT对卵巢癌组织血管生成的影响。结果:LNT对卵巢癌细胞株SKOV3生长具有显著抑制作用,并呈现量效关系;在卵巢癌皮下移植癌动物模型中,注射香菇多试验组瘤重及瘤体积明显低于对照组,PCNA的表达随着LNT的浓度增加而降低;LNT组肿瘤周围的血管数明显少于对照组。结论:LNT可明显抑制体外培养卵巢癌细胞株SKOV3及卵巢癌皮下移植瘤的生长。

纳秒级陡脉冲对人卵巢癌细胞SKOV_3生长抑制及诱导凋亡作用

目的探讨纳秒级陡脉冲对人卵巢癌细胞的生长抑制和凋亡诱导作用。方法采用人卵巢癌细胞SKOV3,应用MTT比色法,倒置显微镜,荧光显微镜及Annexin-FITC技术等方法进行检测和观察。结果中(8.5kV/cm)、高(10kV/cm)场强处理组对SKOV3细胞活性具有明显抑制作用,呈剂量依赖性,在处理后2～4h内呈时间依赖性;倒置显微镜和荧光显微镜下观察到典型的凋亡细胞形态;流式细胞仪示,中、高场强处理组早期凋亡率分别为(22.21±2.71)%、(57.30±6.51)%,与对照组(3.04±0.44)%比较均有显著性差异。结论一定范围内的纳秒级陡脉冲能明显抑制SKOV3细胞增殖,亦诱导SKOV3细胞凋亡。

c-af-1反义寡核苷酸转染对人卵巢癌SKOV_3细胞增殖的抑制作用

目的:探讨c-raf-1基因反义寡核苷酸转染对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法:实验分3组:正常对照组、c-raf-1正义治疗组、c-raf-1反义治疗组。脂质体转染后不同时间分别进行M TT试验、集落形成试验、荧光显微镜检测、蛋白质荧光强度测定,以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、蛋白质表达有无差别。结果:反义治疗组与正义治疗组比较:转染72h OD值分别0.272与1.307(P<0.05);克隆形成率分别为30.6%与75.0%(P<0.05);凋亡率分别为19.7%与9.2%(P<0.05),同时明显地下调P74蛋白质的表达水平(P<0.05)。结论:c-raf-1反义寡核苷酸对人卵巢癌SKOV3细胞的增殖有明显的抑制作用。

c-erbB-2与c-raf-1反义寡核苷酸转染对卵巢癌SKOV_3细胞的作用

目的:探讨c-erbB-2与c-raf-1基因ASODN联合转染对人卵巢癌细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法:实验分为7组:对照组、c-erbB-2正义治疗组、c-raf-1正义治疗组、c-erbB-2反义治疗组、c-raf-1反义治疗组、全剂量联合治疗组和半剂量联合治疗组。脂质体转染后不同时间分别进行MTT试验、集落形成试验、荧光显微镜检测、蛋白质荧光强度测定与免疫组织化学检查,以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、蛋白质表达有无差别。结果:与对照组比较,全剂量联合治疗组和半剂量联合治疗组,转染72h的光密度值分别为0.151(P<0.005)和0.073(P<0.005),增殖抑制率分别达到了88.7%和94.5%,克隆形成率分别为19.4%(P<0.01)和12.8%(P<0.01),凋亡率分别为24.3%(P<0.05)和31.5%(P<0.01),同时明显地下调了c-erbB-2、c-raf-1、PCNA、c-jun、c-fos基因蛋白质的表达水平。结论:c-erbB-2与c-raf-1基因反义寡核苷酸联合转染对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用优于单反义基因,其对卵巢癌细胞增殖的抑制作用可能通过下调c-erbB-2、c-raf-1、PCNA、c-jun、c-fos基因蛋白的表达水平实现。

环状RNA hsa-circ-0006361对卵巢癌SKOV3细胞小鼠移植瘤生长的影响

目的:基于前期RNA-seq测序发现hsa-circ-0006361在卵巢癌中高表达,为研究hsa-circ-0006361在上皮性卵巢癌发生发展中的作用,我们研究了hsa-circ-0006361对人上皮性卵巢癌裸鼠移植瘤生长、裸鼠生存时间的影响。方法:分离细胞核与细胞质后分别提取RNA进行RT-qPCR及琼脂糖凝胶电泳分析,验证hsa-circ-0006361为环状RNA并确定其亚细胞定位。构建hsa-circ-0006361表达载体,转染SKOV3卵巢癌细胞后通过G418筛选得到hsa-circ-0006361稳定表达及空载体circ-vector298卵巢癌细胞株。通过小鼠皮下注射上述卵巢癌细胞建立卵巢癌裸鼠移植瘤模型,评价hsa-circ-0006361表达对卵巢癌细胞移植瘤生长及裸鼠存活时间的影响。结果:hsa-circ-0006361是主要分布在细胞质的环状RNA。hsa-circ-0006361过表达细胞株组裸鼠皮下移植瘤生长与circ-vector298组相比,从接种后第12天开始生长速度明显加快(P<0.05),而hsa-circ-0006361实验组小鼠体重相比circ-vector298对照组,第9天起体重明显更轻(P<0.05),并且实验组小鼠存活时间明显缩短(P<0.05)。结论:hsa-circ-0006361是主要分布在细胞浆的环状RNA,其在卵巢癌中高表达并促进卵巢癌小鼠移植瘤的生长与腹腔转移,缩短荷瘤小鼠生存时间。