羟基磷灰石纳米粒子对卵巢癌作用的体外实验研究

目的探讨羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HAP)纳米粒子对卵巢癌细胞株SKOV3生长的作用。方法通过细胞毒性试验观察HAP纳米粒子对细胞生长的作用,测定HAP纳米粒子的量效曲线和时效曲线。通过丫啶橙/溴化乙啶染色荧光显微镜观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期来观察HAP粒子对细胞凋亡的作用。结果HAP纳米粒子对SKOV3细胞生长具有抑制作用,当细胞的抑制率为30%、50%和70%时,该纳米粒子的浓度分别为8.53mg/L、26.52mg/L和61.99mg/L。形态学和定量的检测均证实HAP纳米粒子有诱导细胞凋亡的趋势,其凋亡率为(38.32±17.87)%,而对照组为(11.88±7.69)%,两组间差异显著,P<0.05。并且HAP纳米粒子作用后,S期细胞明显少于对照组,而G0/G1期细胞明显多于对照组,两组间差异显著,P<0.05。结论HAP纳米粒子对卵巢癌细胞株SKOV3的生长具有明显的抑制作用,其作用机制可能是诱导肿瘤细胞凋亡。

抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体的生物学活性研究

背景与目的目前,常规疗法已难以提高卵巢癌患者的生存率,已有实验数据及临床前试验结果表明,双特异性抗体能有效介导效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。本研究旨在通过检测抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体(BHL-I)的生物学活性,为其临床前试验及应用提供实验依据。方法观察BHL-I介导的外周血淋巴细胞(peripheralbloodlymphocyte,PBL)与靶细胞SKOV3结合、MTT法检测外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)增殖及PBL对靶细胞SKOV3杀伤效应,ELISA法检测杀伤过程中PBL分泌hIFN-γ、hTNF-α变化。结果BHL-I介导的花环形成率(15.7%)显著高于对照组(11.1%)(P<0.01);在抗原存在下,BHL-I显著促进PBMC增殖和PBL对靶细胞的杀伤(P<0.01),且杀伤率与花环形成率呈正相关(r=0.946);杀伤过程中上清液中hIFN-γ、hTNF-α显著增高(P<0.01)。结论BHL-I能介导PBL和SKOV3结合并活化PBL特异杀伤效应,杀伤可能与其hIFN-γ、hTNF-α表达增高有关。

纳秒级陡脉冲对人卵巢癌细胞SKOV_3生长抑制及诱导凋亡作用

目的探讨纳秒级陡脉冲对人卵巢癌细胞的生长抑制和凋亡诱导作用。方法采用人卵巢癌细胞SKOV3,应用MTT比色法,倒置显微镜,荧光显微镜及Annexin-FITC技术等方法进行检测和观察。结果中(8.5kV/cm)、高(10kV/cm)场强处理组对SKOV3细胞活性具有明显抑制作用,呈剂量依赖性,在处理后2～4h内呈时间依赖性;倒置显微镜和荧光显微镜下观察到典型的凋亡细胞形态;流式细胞仪示,中、高场强处理组早期凋亡率分别为(22.21±2.71)%、(57.30±6.51)%,与对照组(3.04±0.44)%比较均有显著性差异。结论一定范围内的纳秒级陡脉冲能明显抑制SKOV3细胞增殖,亦诱导SKOV3细胞凋亡。

人卵巢癌永生化细胞系BUPH:OVSC-2的建立及其生物学特性研究

背景与目的:利用永生化技术建立预期表型的细胞系,已成为建系的重要手段之一,而人卵巢癌永生化细胞系的建立国内外少有报道。本文介绍人卵巢肉瘤样癌永生化细胞系的建立,以及对其生物学特性的研究。方法:以手术切除的卵巢肉瘤样癌腹壁转移组织为材料,进行体外培养。将永生化基因SV40T抗原基因转染第10代细胞,经筛选,抗性克隆扩大培养,得到永生化细胞系。通过光学显微镜、电子显微镜、生长曲线测定、染色体分析、双层软琼脂培养、裸鼠接种、免疫组化等,研究其生物学特性,并与其来源细胞的生物学特性进行比较。结果:建立一株人卵巢肉瘤样癌永生化细胞系,命名为BUPH:OVSC-2,现已传至90余代。其生物学特性为:形态学观察细胞呈肉瘤样细胞形态,超微结构证实为上皮起源;细胞生长旺盛;具有恶性细胞的特征,恶性度高。通过比较,与其来源细胞的生物学特性无明显差别。结论:BUPH:OVSC-2为一株恶性度高的人卵巢肉瘤样癌永生化细胞系,保留了其来源细胞的生物学特性,可作为卵巢肉瘤样癌研究的实验模型。

染色体2p22的过度扩增及hmsh2基因的高表达与卵巢癌紫杉醇耐药相关性的研究

目的研究染色体特定区域DNA拷贝改变、基因差异表达及其与紫杉醇耐药的关系。方法运用比较基因组杂交(comparativegenomichybridization,CGH)及RTPCR技术,分析卵巢癌紫杉醇耐药株染色体基因组变化和hmsh2基因在卵巢癌组织中的表达。结果CGH结果显示最有意义的变化是卵巢癌紫杉醇耐药株OC3/Tax300细胞染色体2p22过度扩增。RTPCR检测发现hmsh2基因在OC3/Tax300细胞高度表达。hmsh2基因表达阳性率在组1和组2分别为93.9%(31/33)及47.6%(10/21),差异有显著性;在低分化癌为93.3%,显著高于中、高分化癌的54.2%。结论2p22拷贝数的过度扩增及hmsh2基因的高度表达可能与卵巢癌紫杉醇耐药相关。

6B11抗独特型微抗体负载树突状细胞对卵巢癌细胞系细胞杀伤作用的体外研究

目的 用 6B1 1抗独特型微抗体体外负载树突状细胞 (DC) ,以期诱导出抗原特异性的抗肿瘤免疫反应。方法 分离培养HLA -A2 +健康人外周血树突状细胞 ,培养过程中用 6B1 1微抗体负载 ,无关抗原F (ab)’2负载及未负载组为对照。光镜、电镜下观察树突的形态 ;流式细胞仪检测DC表面分子表达 ;3 H -TdR掺入法测DC刺激自体T细胞增殖 ;51 Cr 6h释放试验测激活的T细胞对卵巢癌细胞系的杀伤。结果 培养的树突细胞有典型形态 ,CD80、CD86、HLA -DR等表面分子呈高表达 (分别为 6 5 %、 86 2 %、 93 7% ) ;6B1 1微抗体负载的DC不仅能刺激自体T细胞的增殖 ,而且其诱导的CTL细胞对HLA -A2 +、OC1 6 6 - 9+卵巢癌细胞系HOC1A有特异性的杀伤 ,结论 6B1 1抗独特型微抗体模拟卵巢癌抗原OC1 6 6 - 9负载树突状细胞在体外可以诱导出抗原特异性的细胞毒T细胞 ,为进一步研究 6B1

卵巢癌细胞对顺铂耐药机制的研究

目的 :探明卵巢癌对顺铂产生耐药的机理。方法 :采用顺铂体外诱导法建立卵巢癌耐药细胞株HO 8910 / 2。MTT法测定其耐药倍数和交叉耐药性 ,原子吸收法测定细胞内Pt浓度 ,分光光度法测定GSH、GST ,流式细胞仪分析细胞周期 ,检测bcl 2和P GP的表达。结果 :HO 8910 / 2耐顺铂是亲代细胞HO 8910的 6 6倍 ,与 5 FU ,ADR有交叉耐药性。对照亲代细胞 ,耐药细胞中GSH含量与GST活性明显增高 ,细胞G2 /M比例增加 ,细胞内铂 (Pt)摄入和蓄积减少 ,bcl 2表达阳性细胞增多 ,P GP无变化。结论 :细胞内药物浓度下降、bcl 2的表达增加、GSH与GST对铂化合物解毒作用的增强可能是HO 8910 /

抑制Her-2基因的表达对NK-92细胞杀伤SKOV3细胞活性影响的研究

目的:探讨抑制Her-2基因的表达对NK-92细胞杀伤SKOV3细胞活性的影响。方法:Her-2siRNA质粒在脂质体介导下转染到包装病毒细胞株PT67中,将病毒上清转染SKOV3,经嘌呤霉素筛选得到稳定抑制Her-2基因表达的SKOV3/siRNA-1、SKOV3/siRNA-2细胞株,并分别通过RT-PCR和免疫组化法鉴定抑制Her-2表达的效果。应用LDH法检测NK-92细胞对SKOV3、SKOV3/siRNA-1、SKOV3/siRNA-2、SKOV3/siRNA-neg-ative control的杀伤活性。结果:Her-2/siRNA-1、Her-2/siRNA-2均可有效沉默Her-2mR-NA和蛋白的表达。NK-92细胞对SKOV3、SKOV3/siRNA-negative control的杀伤率分别为21%、20%,而对SKOV3/siRNA-1、SKOV3/siRNA-2的杀伤率分别为33%、45%(P<0·05)。结论:抑制Her-2基因的表达可增强NK-92细胞对SKOV3细胞的杀伤活性。RNA干扰技术联合NK-92细胞为高表达Her-2基因卵巢癌的生物治疗提供了一种新的策略。

卵巢癌细胞系SKOV3冻融抗原诱导CTL特异性杀瘤效应的研究

目的探讨卵巢癌冻融抗原对T淋巴细胞的增殖作用及其诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在体外杀伤卵巢癌细胞的抗原特异性细胞毒性效应。方法采用免疫磁珠分离法(magneticactivatedcellsorting,MACS)分离纯化正常人外周血CD+3T细胞,体外以SKOV3卵巢癌细胞中提取的可溶性肿瘤抗原加以刺激。溴标法检测肿瘤抗原对T细胞增殖的影响;MTT法测定肿瘤抗原诱导的CTL体外杀伤卵巢癌细胞的能力;利用绒毛膜癌细胞抗原对比观察肿瘤抗原诱导CTL杀伤肿瘤细胞的抗原特异性。结果卵巢癌细胞抗原有很强的促进T淋巴细胞增殖的作用,且存在时间依赖性,在24h时促进作用最强。SKOV3抗原诱导的CTL在体外对SKOV3细胞的杀伤率为68.38%,显著高于它对JAR绒毛膜癌细胞的杀伤率(18.31%);而JAR细胞抗原诱导的CTL对JAR和SKOV3细胞的杀伤率分别为61.02%和14.79%,有显著的抗原特异性(P=0.0001)。结论卵巢癌细胞冻融抗原诱导的CTL在体外具有很强的增殖能力和抗原特异性杀伤卵巢癌细胞的作用。

Notch1信号蛋白在卵巢癌细胞系中的表达

目的:检测卵巢癌细胞系中Notch1信号蛋白的表达,为在卵巢癌细胞中对Noah1进行RNA干涉研究的体外实验筛选靶细胞。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法及Western blotting对卵巢癌细胞系SKOV3、HO-8910、HO-8910-PM和3AO中Notch1进行检测。结果:Notch1信号蛋白在4种卵巢癌细胞系中均有表达,其在HO-8910-PM中表现为高表达,在SKOV3和3AO中表现为中等表达,在HO-8910中表现为低表达。结论:HO-8910-PM适合作为靶细胞,进行Notch1信号蛋白的RNA干涉研究。

人卵巢肉瘤样癌细胞系BUPH:OVSC-1的建立及其生物学特性

目的:介绍人卵巢肉瘤样癌细胞系的建立,研究其生物学特性。方法:以手术切除的卵巢肉瘤样癌腹壁转移组织为材料,进行体外培养,建立人卵巢肉瘤样癌细胞系。通过光学显微镜、电子显微镜、生长曲线测定、染色体分析、双层软琼脂培养、裸鼠接种、免疫组化等,对其生物学特性进行研究。结果:首次建立一株人卵巢肉瘤样癌细胞系,命名为BUPH:OVSC-1,现已传至100余代。其生物学特性为,形态学观察细胞呈肉瘤样细胞形态,超微结构证实为上皮起源;细胞生长旺盛;染色体为假二倍体,染色体丢失,且有三条标记染色体;具有集落形成能力;裸鼠皮下种植瘤生长快,与原组织形态相似;组织化学奥辛蓝过碘酸雪夫氏反应、免疫组化角蛋白7及波形蛋白染色均阳性。结论:BUPH:OVSC-1为一株高度恶性人卵巢癌细胞系,符合人卵巢肉瘤样癌细胞系的特征,可作为卵巢肉瘤样癌研究的实验模型。

选择性COX-2抑制剂尼美舒利对人卵巢癌细胞株移植瘤生长的不同影响

目的:探讨选择性COX-2抑制剂尼美舒利(Nimesulide)对COX-2表达不同的人卵巢癌细胞株移植瘤生长的影响。方法:培养人卵巢癌细胞株SKOV-3(COX-2表达阴性)和OVCAR-3(COX-2表达阳性),制作裸鼠皮下移植瘤模型。应用尼美舒利干预,观察各组肿瘤的生长情况,绘制生长曲线,计算抑瘤率。测定移植瘤组织内血管内皮细胞生长因子(VEGF)含量。结果:SKOV-3组治疗组的肿瘤体积与对照组比较没有统计学差异(1.026 4±0.34)cm3vs(1.668 2±0.94)cm3(P=0.19>0.05);两组肿瘤的VEGF含量比较为没有统计学差异(1 481.1±235.61)pg/mL vs(1 648±179.02)pg/mL(P=0.09>0.05);两组的肿瘤生长曲线没有显著分离。OVCAR-3组治疗组的肿瘤体积(0.139 6±0.061)cm3小于对照组的肿瘤体积(0.263 4±0.056)cm3(P=0.01),抑瘤率为56.3%;治疗组的肿瘤生长曲线较对照组低平。治疗组肿瘤的VEGF含量为(1 070.4±578.29)pg/mL,低于对照组肿瘤的VEGF含量(1 641.3±541.84)pg/mL(P=0.04)。结论:选择性COX-2抑制剂对COX-2表达阳性的人卵巢癌组织有抑制生长的作用,对COX-2表达阴性的人卵巢癌组织的生长没有表现出抑制作用,这可能与COX-2抑制剂对COX-2表达不同的肿瘤组织内VEGF含量有不同的影响相关。

人卵巢癌细胞系OV1228的建立及其生物学特性

目的用人卵巢癌组织建立新的卵巢癌细胞系，为探讨卵巢癌细胞的发病机制和治疗药物的筛选提供可靠的材料。方法选用人复发卵巢癌组织，进行肿瘤细胞原代培养，通过克隆稀释法，培养建立卵巢癌细胞系，进行体外传代，并通过细胞形态学、生长动力学以及致瘤性来分析其生物学特性。结果该卵巢癌细胞系已在体外培养生存18个月以上，传代超过80余代，被命名为OV1228。其生物学特性显示：倍增时间为29．39h；软琼脂集落形成率为17．5％；接种至裸鼠后具有较高的致瘤性；染色体核型分析为多倍体，众数为21～61条；透射电镜下可观察到卵巢癌细胞表面有少量短的细胞突起，部分细胞间可见发育比较差的桥粒样结构，具有明显的恶性卵巢癌细胞特征。结论OV1228经体外长期培养后已形成永生化卵巢癌细胞系，并具有明显的恶性特征，为开展人类卵巢癌的基础及临床研究提供了理想的实验材料。

人卵巢癌SCID小鼠移植瘤模型、细胞系建立及其生物学特性研究

目的 建立人卵巢癌SCID小鼠移植瘤模型和相应体外细胞系。方法 将病理证实的人卵巢浆液性乳头状腺癌手术切除标本移植于SCID小鼠皮下 ,成瘤后行鼠间传代 ,取移植瘤细胞体外分离培养、传代和建系 ,并应用细胞、分子生物学手段对移植瘤和建系细胞进行一系列生物学特性检测。结果 历时 14个月传至 5代 ,皮下移植瘤存活率为 90 % ,持续 6个月 ,体外建系 (OVA 319)细胞生长稳定。镜下观察组织形态学和超微结构符合原肿瘤组织基本特征 ;染色体分布在 12～ 46条之间 ,多为异倍体 ,显示人类肿瘤异常染色体 ;流式细胞术和RT PCR技术分析原代、体内移植瘤和OVA 319细胞结果一致 ,表现为瘤细胞生长活跃、细胞周期分布相仿 ,MAGE 2基因在mRNA水平异常表达。结论 人卵巢癌SCID小鼠移植瘤模型和OVA

核桃楸提取物抑制人卵巢癌细胞HO-8910PM增殖的实验研究

目的研究中药核桃楸提取物对人卵巢癌细胞HO-8910PM增殖能力的影响。方法采用层流分离法提取出核桃楸6种有效成分,分别以10^-8 mg/mL、10^-7 mg/mL、10^-6 mg/mL、10^-5 mg/mL浓度作用于卵巢癌细胞HO-8910PM,并设立空白对照组,以噻唑蓝比色法和形态学观察法检测核桃楸提取物对癌细胞生长的抑制作用。结果核桃楸提取物的6种有效成分结构鉴定分别为a-羟基-四氢萘醌(Y1)、胡桃醌(Y2)、4,8-二羟基萘酚-1-0-β-D-[6′-0-(3″,5″-二甲氧基-4″-羟基苯甲酰基)]葡萄糖苷(Y3)、4,8-二羟基萘酚-β-D-(6′-乙酰氧基葡萄糖苷)(Y4)、4,8-二羟基萘酚-β-D-葡萄糖苷(Y5)、4,5,8-二羟基-ɑ-四氢萘醌-5-0-β-D-[6′-0-(4″-羟基-3″,5″-二甲氧基苯甲酰基)]葡萄糖苷(Y6)。Y1、Y3、Y6这3种药物随着药物浓度的增高和作用时间的延长,对HO-8910PM细胞增殖的抑制率也相应增高,并且Y1、Y3的浓度依赖性明显,Y6的时间依赖性明显且在短时间低浓度组(10^-8 mg/mL)表现出了明显的肿瘤抑制作用;其他药物无规律变化。电镜下观察各药物组HO-8910 PM细胞随着药物浓度的增高和作用时间的延长,细胞出现程序性死亡。结论核桃楸提取物的6种有效成分中,有3种能够抑制人卵巢癌细胞HO-8910PM的增殖,且抑制作用存在剂量、时间依赖性。

一株新的卵巢癌细胞系的建立及其生物学特性分析

目的 从人卵巢癌组织建立一株卵巢癌细胞系 ,为卵巢癌发病机制研究和治疗药物筛选提供可靠的材料。 方法 取手术切除的卵巢癌组织 ,进行组织块培养法 ,待长满 90 %汇合面后消化传代培养 ,并进行形态学、生长动力学及致瘤性等生物学特性分析。 结果 该卵巢癌细胞系已在体外培养生存 1年以上 ,传 80余代 ,命名为湖南卵巢癌细胞系 1号 (HOC1) ,其生物学特性显示 :这些细胞系体外生长的倍增时间为 47.2h ;软琼脂集落形成率为 18.5 % ;接种至裸鼠后具 10 0 %致瘤性 ;染色体核型分析为非整倍体 ,众数为 74～ 92条 ;透射电镜下可观察到卵巢癌细胞表面含有丰富的微绒毛 ,胞浆内含有丰富的核糖体。 结论 该卵巢癌细胞系经体外长期培养后已形成永生化细胞系 ,并具有明显的恶性表型特征。

脂质体介导的小发夹干扰RNA对卵巢癌顺铂耐药细胞中切除修复交叉互补基因1表达的影响

目的:探讨脂质体介导的小发夹干扰RNA(shRNA)对卵巢癌顺铂耐药细胞中切除修复交叉互补基因1(ERCC1)表达的影响。方法:设计合成针对ERCC1基因的小发夹干扰RNA(ERCC1-shRNA),构建携带ERCC1-shRNA的重组质粒表达载体,采用脂质体Lipofectamine 2000转染COC1/DDP细胞。分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(Western blot)检测转染后细胞中ERCC1 mRNA及蛋白的表达,流式细胞计数检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果:转染后COC1/DDP细胞中ERCC1mRNA表达较转染前明显降低(F=203.73,P<0.01),ERCC1蛋白表达亦显著下降。RNA干扰ERCC1基因后48h,COC1/DDP细胞的凋亡率较对照组有明显升高(t=20.65,P<0.01)。结论:构建的重组质粒表达载体转染COC1/DDP细胞可明显下调ERCC1 mRNA及蛋白的表达,诱导肿瘤细胞凋亡。

川芎嗪对人卵巢癌耐药细胞株A2780/ADM逆转作用实验研究

目的探讨川芎嗪(TMP)逆转卵巢癌A2780/ADM细胞对阿霉素(ADM)的耐药作用及机制。方法应用MTT法测定细胞的药敏性;用荧光分光光度法测定细胞内阿霉素浓度的变化;采用流式细胞术检测耐药细胞凋亡率的变化。结果非细胞毒性剂量川芎嗪能显著降低卵巢癌耐药细胞株A2780/ADM的IC50,逆转倍数为2.07倍;非细胞毒性剂量川芎嗪能显著增加耐药细胞内ADM的浓度和耐药细胞的凋亡百分率,显著降低P-gp的表达。结论川芎嗪具逆转卵巢癌耐药细胞株A2780/ADM细胞对阿霉素的耐药性,其逆转机制可能与增加细胞内ADM浓度和抑制该细胞P-gp的表达有关。

PI3K/Akt信号转导通路与卵巢癌顺铂耐药相关性的研究

目的:研究卵巢癌顺铂(DDP)耐药与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号转导通路的关系。方法:根据LY294002作用浓度将SKOV3和SKOV3/DDP细胞分别分为5μmol/L+DDP、10μmol/L+DDP、20μmol/L+DDP、40μmol/L+DDP、DDP组及对照组。MTT法检测40μmol/L LY294002对SKOV3和SKOV3/DDP细胞DDP敏感性的影响;Western blot法检测SKOV3和SKOV3/DDP细胞各实验组PI3K、Akt表达水平。结果:SKOV3和SKOV3/DDP细胞经LY29400240μmol/L作用后,对DDP敏感性分别增加了67.36%、76.56%。LY294002可降低SKOV3和SKOV3/DDP细胞中PI3K和Akt表达。SKOV3细胞对照组PI3K和Akt蛋白相对浓度值均低于SKOV3/DDP细胞对照组(t分别为26.005和23.477,均P<0.05)。结论:PI3K/Akt信号通路异常与卵巢癌DDP耐药有关,抑制PI3K/Akt信号通路能增强卵巢癌DDP敏感性。

免疫调节分子在卵巢上皮癌中的表达

目的 了解5种卵巢上皮癌(EOC)细胞系中免疫调节分子HLAⅠ、HLAⅡ、CD54、CD80)的表达,探讨EOC逃避机体免疫监视的机制。方法 采用流式细胞仪检测5种人EOC细胞系的HLAⅠ、HLAⅡ、CD54、CD80)表达;应用RT-PCR检测CD80mRNA的表达。结果 5种细胞系中仅COC1和COC2高表达HLAⅠ类分子(阳性细胞率在99％以上)。5种细胞系HLAⅡ类分子的表达均很低(1.40％～12.94％),SKOV3细胞CD54的表达较高(78.00％),COC1次之(33.25％),余者均较低。除COC2低表达CD80(6.63％)外,其余4种细胞系均不表达CD80。结论 5种EOC细胞系存在免疫调节分子表达的异常(如HLAⅠ下调、CD80的缺乏等),EOC细胞可能通过多个方面逃避机体的免疫监视。