BRMS1 shRNA表达载体的构建及对卵巢癌细胞转移的影响

目的探讨乳腺癌转移抑制基因1(BRMS1)表达抑制对人卵巢癌细胞转移能力的影响及机制。方法构建靶向BRMS1基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-BRMS1,并转染人卵巢癌OVCAR3细胞,经G418筛选获得稳定转染株。采用实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测BRMS1 mRNA和蛋白的表达,采用黏附实验检测细胞的黏附能力,采用Tr-answell小室法检测细胞的体外侵袭和迁移能力,采用实时荧光定量PCR法检测基因沉默后miR-146a的表达。结果经酶切和DNA测序证明重组载体构建成功。稳定转染BRMS1 shRNA后,OVCAR3细胞中BRMS1 mRNA和蛋白表达均受到明显抑制。BRMS1表达下调后,细胞的黏附、侵袭和迁移能力较对照组明显增强。干扰组细胞的miR-146a mRNA表达下调了(44.69±4.60)%。结论干扰BRMS1基因的表达可促进卵巢癌细胞的黏附、侵袭和迁移,其机制可能与下调miR-146a的表达有关。

RNA干扰阻抑Bax i nhi bitor-1(bi-1)基因表达对卵巢癌细胞凋亡的影响

目的:研究RNA干扰(RNAi)效应对人卵巢癌细胞株HO8910PM和HO8910中bi-1基因表达的抑制作用和凋亡诱导作用。方法:把表达bi-1shRNA的各重组干扰质粒转染到HO8910PM和HO8910细胞中,RT-PCR和Western blotting法检测bi-1基因mRNA和蛋白表达水平;流式细胞术和Hoechst 33258/PI荧光染色检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果:与对照组细胞相比较,转染4种候选干扰质粒组细胞中bi-1的mRNA和蛋白表达水平均明显下降(P<0.05),以转染pmU6-b4组细胞的表达抑制率最高,在HO8910PM细胞中的抑制率分别为(45.50±3.04)%和(51.08±4.96)%,在HO8910细胞中的抑制率分别为(37.29±3.69)%和(44.96±4.28)%;流式细胞术结果表明,与对照组细胞相比较,转染pmU6-b4质粒24 h、48 h、72 h、96 h的HO8910PM细胞中亚二倍体峰比值明显升高(P<0.05),以转染72 h组细胞的比值最高,达到(25.89±5.63)%,而HO8910细胞中无亚二倍体峰出现;荧光显微镜下可见转染pmU6-b4质粒72h的HO8910PM细胞出现细胞核缩小、染色质固缩和核断裂,而HO8910细胞核无明显变化。结论:针对bi-1的siRNA能特异有效地下调HO8910PM和HO8910细胞中bi-1基因的表达,不同序列特异性的siRNA下调bi-1基因表达的能力不同;瞬时转染质粒pmU6-b4能有效诱导HO8910PM细胞凋亡,但不能诱导HO8910细胞凋亡。

siRNA抑制卵巢癌SKOV3细胞EPAS1表达及细胞增殖的体外研究

目的:探讨RNA干扰对卵巢癌SKOV3细胞中缺氧诱导因子2(EPAS1)表达及细胞增殖的抑制作用。方法:合成靶向EPAS1的小干扰RNA(siRNA)并进行转染。实验分为实验组、阳性对照组、阴性对照组及空白对照组。采用RT-PCR和western blotting检测各组细胞EPAS1 mRNA和蛋白表达水平,通过MTT法检测各组细胞增殖情况。结果:应用EPAS1-siRNA转染卵巢癌SKOV3细胞后,实验组的EPAS1mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖明显受限,与其他三组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组基因沉默效率为63.9%,蛋白抑制率为48.1%,细胞增殖抑制率为56.9%。结论:靶向EPAS1基因的siRNA可以抑制卵巢癌SKOV3细胞中EPAS1的表达,从而抑制SKOV3细胞在体外的增殖。

乳腺癌转移抑制基因1对卵巢癌细胞血管生成的影响及其机制探讨

目的探讨乳腺癌转移抑制基因1(breast cancer metastasis suppressor 1,BRMS1)对人卵巢癌细胞OVCAR3诱导血管内皮细胞形成管腔能力的影响及可能的机制。方法应用脂质体介导的方法将BRMS1shRNA重组质粒转染人卵巢癌细胞OVCAR3,经G418筛选获得稳定转染株。荧光定量PCR和Western blot法检测BRMS1mRNA和蛋白的表达水平;体外血管形成实验检测OVCAR3诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的血管形成能力;Western blot法检测生长抑制因子4(ING4)和白细胞介素-6(IL-6)的蛋白表达情况。结果稳定转染BRMS1shRNA后,OVCAR3细胞BRMS1的表达在mRNA和蛋白水平均受到明显抑制。体外血管形成实验提示,BRMS1表达下调后能显著促进卵巢癌细胞诱导的HUVECs形成管腔样结构的能力;Western blot法显示干扰组中ING4蛋白表达量较对照组下降30%,而IL-6蛋白表达上调,是空白对照组的1.5倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论干扰BRMS1基因的表达可促进卵巢癌细胞诱导血管形成能力,其机制可能与调节下游基因ING4和IL-6的表达有关。

siRNA沉默结肠癌转移相关基因1表达对人类卵巢癌细胞株侵袭转移的影响

目的 检测结肠癌转移相关基因1（MACC1）在卵巢癌细胞株中的表达,并探讨用siRNA技术抑制其表达对卵巢癌细胞生物学行为的影响.方法 应用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）及Western blot法检测OVCAR3、ES-2、SKOV3、HO-8910卵巢癌细胞株中MACC1的表达,合成MACC1特异性siRNA并转染OVCAR3细胞,利用RT-qPCR筛选并鉴定MACC 1基因有效沉默后,应用体外黏附实验、Transwell迁移及侵袭实验、体外血管拟态实验检测MACC1基因沉默后OVCAR3细胞的体外黏附、迁移、侵袭及血管生成能力的变化.结果 OVCAR3细胞较其他卵巢癌细胞株高表达MACC1.MACC1基因沉默后,OVCAR3细胞的体外黏附能力受到不同程度的抑制;Transwell迁移实验中,MACC1 siRNA干扰的OVCAR3细胞（干扰组）转入底层膜的细胞数为（245.5±12.8）个,低于阴性对照组和空白对照组[分别为（500.3±16.5）、（496.3±13.1）个,均P＜0.05]; Transwell侵袭实验中,干扰组转入底层膜的细胞数为（185.3±14.1）个,低于阴性对照组和空白对照组[分别为（405.7±9.1）、（416.3±11.5）个,均P＜0.05];体外血管拟态显示干扰组细胞多呈散在分布,连接减少,形成的完整结构少.结论 利用siRNA技术抑制MACC1基因表达可有效抑制卵巢癌OVCAR3细胞的体外转移和侵袭能力,MACC1有望成为卵巢癌治疗的靶基因.

SiRNA干扰结肠癌转移相关基因1表达对卵巢癌顺铂化疗耐药性的影响

目的:利用RNA干扰技术抑制结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer 1,MACC1)在顺铂(cisplatin,DDP)耐药的卵巢癌细胞株SKOV-3/DDP中的表达,并探讨其对DDP化疗耐药性的影响。方法:RNA干扰分为3组,空白对照组为未经处理的SKOV-3/DDP细胞,阴性对照组为空质粒转染的SKOV-3/DDP-shVector细胞,实验组为MACC1-shRNA重组质粒转染的SKOV-3/DDP-shMACC1细胞。反转录PCR法和蛋白质印迹法检测稳定转染后SKOV-3/DDP细胞中MACC1 mRNA和蛋白的表达情况,MTT法检测细胞对DDP的耐药性变化,FCM法检测细胞凋亡变化。结果:相比于未转染组SKOV-3/DDP细胞,MACC1-shRNA转染组SKOV-3/DDP-shMACC1细胞中MACC1的mRNA及蛋白水平均明显下调[下调百分率分别为(83.39±1.26)%和(82.25±2.94)%,P<0.05]。DDP对SKOV-3/DDP-shMACC1细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC_(50))值与未转染组和空质粒转染组细胞的IC_(50)值比较,均明显降低[(26.09±0.91)μmol/L vs(47.50±0.40)μmol/L和(47.08±0.45)μmol/L,P<0.05]。SKOV-3/DDP-shMACC1细胞凋亡率明显提高[(13.77±0.60)%vs(3.63±0.30)%和(4.23±0.30)%,P<0.05]。结论:RNA干扰抑制MACC1基因表达能增强卵巢癌耐药细胞SKOV-3/DDP对DDP的敏感性。

shRNA介导沉默肺腺癌转移相关转录本1表达对人卵巢癌细胞株OVCAR3侵袭与转移的影响

目的检测肺腺癌转移相关转录本1（MALAT-1）在人卵巢癌细胞株中的表达，并探讨shRNA介导沉默MALAT-1表达对卵巢癌细胞OVCAR3生物学功能的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测ES-2、SKOV3、OVCAR3、A27804株卵巢癌细胞中MALAT-1mRNA水平的表达差异，设计构建4条特异性干扰MALAT-1表达的shRNA—pGPU6／GFP／Neo表达载体和-条不干扰任何基因表达的空载体作为阴性对照，转染高表达MALAT-1的OVCAR3细胞，qRT-PCR筛选并鉴定有效沉默MALAT-1的shRNA序列。应用CCK-8比色法、体外黏附与划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验检测MALAT-1沉默后OVCAR3细胞生长增殖、黏附、划痕修复、迁移及侵袭能力的改变。结果筛选出高表达MALAT-1的OVCAR3细胞株，有效沉默MALA-1基因后，OVCAR3细胞株的增殖、划痕修复能力明显抑制，黏附能力有不同程度降低。Transwell迁移实验中，干扰组转入底层膜细胞数量为（52．17±4．48）个，低于阴性对照组的。（286．50±12．23）个和空白对照组的（295．67±6．96）个；在Transwell侵袭实验中，干扰组转入底层膜细胞数为（37．33±2．40）个，低于阴性对照组的（239．00±15．72）个和空白对照组的（222．67±20．85）个，干扰组与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．001）。结论利用shRNA介导沉默MALAT-1的表达可以有效抑制卵巢癌细胞株OVCAR3的增殖、黏附、划痕修复以及迁移、侵袭能力，MALAT-1有望成为卵巢癌治疗的有效靶基因。

通过小干扰RNA沉默mdr-1基因逆转卵巢癌耐药细胞株SKOV3/TAXOL多药耐药的研究

目的 构建靶向于卵巢癌耐药细胞株中高表达的多药耐药-1（mdr-1）基因的短发夹状RNA重组质粒,探讨RNAi沉默技术逆转卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞多药耐药的可行性.方法运用基因克隆技术构建靶向于mdr-1基因的重组质粒PGPU6/GFP/Neo-mdr-1并转染至卵巢癌耐药细胞株SKOV3/TAXOL,反转录聚合酶链反应检测到mdr-1基因表达.CCK-8检测对SKOV3/TAXOL细胞增殖的抑制作用.结果构建的重组质粒PGPU6/GFP/Neo-mdr-1能明显抑制mdr-1基因的表达.蛋白质印迹结果表明,转染重组质粒PGPU6/GFP/Neo-mdr-1的SKOV3/TAXOL靶细胞的抑制率显著提高.RT-PCR检测mdr-1基因mRNA转录水平下降;pPGPU6/GFP/Neo-mdr-1明显抑制SKOV3/TAXOL细胞的增殖.结论重组质粒PGPU6/GFP/Neo-mdr-1可有效地抑制SKOV3/TAXOL细胞内源mdr-1基因的表达和mRNA的转录,并抑制细胞的增殖和促进凋亡的发生,应用RNAi技术,能够逆转卵巢癌细胞对化疗药物的多药耐药.为化疗耐受的肿瘤细胞提供了新的基因治疗手段.

慢病毒介导的VCAM-1基因沉默对人舌鳞癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的:探讨慢病毒介导的血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)基因沉默对裸鼠体内人舌鳞癌细胞移植瘤生长的抑制作用。方法 :构建人舌鳞癌Tca-8113细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为干扰组、阴性对照组和空白对照组,分别瘤内注射含VCAM-1-sh RNA的慢病毒颗粒、含无关序列的慢病毒颗粒或0.9%氯化钠溶液。然后,观察移植瘤的生长情况,绘制移植瘤生长曲线。注射3周后处死裸鼠,称量各组移植瘤质量,并计算抑瘤率。采用HE染色法观察各组移植瘤细胞形态学特征;免疫组织化学法检测移植瘤组织中VCAM-1蛋白的表达水平以及肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD),并分析二者之间的相关性。结果 :干扰组裸鼠移植瘤的生长速度明显小于阴性对照组和空白对照组(P值均<0.05),抑瘤率可达50.0%。3组裸鼠移植瘤组织切片均符合鳞状细胞癌的特征,无明显差异。干扰组移植瘤组织中VCAM-1蛋白的相对表达量及MVD值均明显低于阴性对照组和空白对照组(P值均<0.01)。VCAM-1蛋白表达与MVD呈正相关性(r=0.834,P<0.05)。结论 :慢病毒介导的VCAM-1-sh RNA干扰能通过沉默荷人舌鳞癌细胞裸鼠移植瘤中VCAM-1基因的表达,抑制移植瘤生长及血管生成,提示VCAM-1有望成为口舌腔鳞癌基因治疗的新靶点。

EGFR特异性siRNA促进卵巢癌细胞凋亡的研究

目的观察EGFR基因特异性短发卡状小干扰RNA（siRNA）对人类卵巢癌细胞Skov-3细胞凋亡的影响。方法构建pshRNA—EGFRsiRNA真核基因表达载体，采用脂质体介导的方法将其转染到卵巢癌细胞株Skov-3。实验分为3组：空白对照组（未经转染的人类卵巢癌Skov-5细胞）、非特异性转染组（转染非特异性质粒载体）及特异性转染组。用RT—PCR方法检测mRNA水平的变化，免疫细胞化学方法检测EGFR蛋白水平的变化，流式细胞术检测其对卵巢癌细胞凋亡的影响。结果与空白对照组和非特异转染组相比，转染pshRNA—EGFR后，Skov-3细胞中EGFRmRNA拷贝数明显减少，EGFR蛋白表达水平明显降低。凋亡细胞明显增多，呈时间依赖性，而空白对照组和非特异性转染组无明显的凋亡。结论靶向EGFR基因的siRNA表达载体可以显著抑制其在人类卵巢癌Skov-3细胞的表达，促进细胞凋亡，为卵巢癌的基因治疗提供新的思路。

缺氧诱导因子-1α对口腔鳞状细胞癌血管生成拟态相关基因影响的实验研究

目的探讨沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞移植瘤血管生成拟态(VM)的影响及其可能的机制。方法 (1)沉默Tca8113细胞的HIF-1α,Real time RT-PCR和Western blot验证干扰效率;(2)建立裸鼠皮下移植瘤模型:分为阴性对照组和沉默HIF-1α的干扰组,观察沉默HIF-1α对肿瘤生长的影响并绘制生长曲线;(3)瘤体HE染色及免疫组化CD31染色观察血管形态、微血管密度(MVD)和VM的变化,免疫组化染色观察沉默HIF-1α对血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白表达的影响。结果 (1)移植瘤的生长曲线显示干扰组瘤体的生长速度和体积显著慢于和小于对照组(P<0.05);(2)与对照组相比,干扰组瘤体内的血管形态趋于正常且MVD减小(P<0.05),VM现象少见;(3)与对照组相比,干扰组瘤体组织的VEGF、TGF-β1表达显著减弱,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论口腔鳞癌移植瘤中存在VM现象,VM的形成可能与HIF-1α对靶基因VEGF、TGF-β1的表达调控有关。

低氧影响卵巢癌细胞对泰素的敏感性及其机制

目的研究低氧、低氧诱导因子-1α（HIF-1α）对卵巢癌细胞多药耐药基因（mdr-1）及其编码P-糖蛋白（P-gp）表达的调控，探讨低氧影响卵巢癌细胞对泰素的敏感性及其机制。方法对常氧（21％O2）和低氧（1％O2、5％O2）培养的A2780细胞，应用免疫细胞化学、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot）和四氮唑蓝（MTT）法等，检测HIF—lα mRNA、蛋白以及mdr-1、P-gP的表达水平和对泰素的敏感性。利用RNA干扰（RNAi）技术，构建针对HIF-1α的短发夹状干扰RNA真核表达载体pSiHIF-1α，并转染A2780细胞，检测转染后HIF-1α的基因沉默效果、对mdr-1和P-gP表达的影响及其对泰素敏感性的改变。结果低氧能显著诱导A2780细胞HIF-lα mRNA和蛋白表达水平的上调，HIF-1α mRNA的表达水平与低氧浓度无关，而HIF-1α蛋白表达呈低氧浓度依赖性；低氧能诱导A2780细胞的表达上调，且呈低氧浓度依赖性；低氧A2780细胞对泰素的敏感性较常氧明显降低（P＜0．05）。pSiHIF-1α转染后，低氧A2780细胞能显著下调HIF-1α的表达，明显抑制mdr-1和P-gp的表达，其对泰素的敏感性显著增加。结论低氧能降低A2780细胞对泰素的敏感性，其机制可能是通过HIF-1α调控mdr-1α调控P-gp的表达而实现的。