EphB4基因重组慢病毒载体的构建及在结肠癌细胞中的表达

目的有研究显示EphB4表达异常在结肠癌发生发展中具有重要意义。文中通过构建慢病毒介导稳定过表达EphB4基因的结肠癌细胞株,以期为结肠癌的基因治疗提供一定的实验依据。方法通过PCR反应将人工合成的EphB4基因序列装入pcDNA3.1(+)载体,并通过测序验证重组克隆插入片段的序列信息。将质粒中扩增的目的基因片断克隆装入慢病毒表达载体pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP并进行基因测序以确认慢病毒载体是否成功构建。携带EphB4和EGFP基因的慢病毒通过阳离子脂质体转染293T细胞,收集富含EphB4基因的病毒颗粒上清液,梯度稀释后测定病毒滴度并感染人结肠癌细胞株SW480和Coca-2,通过药物筛选及维持构建稳定过表达EphB4基因的结肠癌细胞株。荧光显微镜下观察各组细胞中绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)表达情况,qPCR检测转染前后各组细胞中靶基因EphB4 mRNA,评价过表达效果。结果含有2964bp人EphB4基因编码区的慢病毒载体pLenti6.3-EphB4-IRES2-EGFP构建成功,基因测序结果完全正确,经慢病毒包装所得病毒上清液Lenti6.3-EphB4滴度为1×108TU/mL。稳转细胞株在荧光显微镜下可见GFP表达,qPCR实验证明转染后SW480及Coca-2细胞中EphB4 mRNA表达水平较转染前明显增加。结论成功扩增、克隆了EphB4基因,并建立其慢病毒表达系统,构建了稳定过表达EphB4基因的结肠癌细胞株,从而对于研究结肠癌的基因治疗提供了实验依据。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除Nrf2基因及Nrf2基因过表达载体的构建

构建核转录相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)敲除HepG2细胞系及Nrf2过表达载体。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,将Nrf2-sgRNA表达载体转入HepG2细胞,嘌呤霉素筛选基因敲除细胞,构建敲除Nrf2基因HepG2细胞系。Nrf2过表达载体的构建,从HepG2细胞提取总RNA,反转录为总cDNA,并以此为模板设计Nrf2引物扩增目的基因,连接,转化,挑取阳性克隆,PCR验证,测序进一步鉴定。结果表明,获得了稳定敲除Nrf2的HepG2细胞及在HepG2细胞中稳定表达的Nrf2过表达载体,为研究Nrf2基因在动物肝损伤中的作用提供了理论依据。