鸡蛋壳Ovocleidin-116(OC-116)研究进展

Ovoeleidin—116（OC-116）是一种与生物钙化紧密关联的古老蛋白质，也是鸡蛋壳钙化层、表面有机层的主要构成组分。在蛋壳钙化层中存在两种OC～116形式：发生糖胺聚糖修饰的蛋白多糖（180～200ku）和不携带糖胺聚糖的糖蛋白（116～120ku）。单核苷酸多态（SNP）研究表明，OC—116与鸡蛋的蛋形指数、蛋壳厚度以及蛋壳强度密切相关。体内及体外研究表明，OC-116能够调控方解石晶体的生长与形态，从而对蛋壳的形成、质地以及强度有重要影响。另外，OC-116能够显著影响蛋壳表面有机层的沉积，可能是鸡蛋防御微生物侵染的关键因素。总之，OC-116是鸡蛋壳中一个重要的基质组分。

OC-116基因第1外显子多态性对长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质的影响

为探讨OC-116基因第1外显子多态性对鸡蛋壳品质的影响,试验以长顺绿壳蛋鸡为材料,采用PCR产物直接测序法对OC-116基因第1外显子区域进行单核苷酸多态性(SNP)筛查,利用一般线性模型分析多态位点对长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质的遗传效应。结果显示,在OC-116基因第1外显子共检测到2个中度多态且完全连锁的SNP位点,分别为g.45667632 T>C和g.45667671 G>A,均产生3种基因型。通过卡方(χ2)检验发现,2个SNPs基因型分布均未偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),共存在2种单倍型和3种双倍型。基因型CC、AA和双倍型H2H2在蛋质量上显著高于基因型TT、GG和双倍型H1H1(P<0.05),基因型TT、GG和双倍型H1H1在蛋形指数上显著高于基因型CT、AG和双倍型H1H2(P<0.05),基因型CT、AG和双倍型H1H2在蛋壳强度上显著高于基因型TT、GG和双倍型H1H1(P<0.05)。综上,基因型CC、AA和双倍型H2H2是改善蛋壳品质的有利基因型和双倍型,揭示g.45667632 T>C位点和g.45667671 G>A位点可作为蛋壳性状选择的标记性位点。

蛋鸡OC-116基因的克隆和序列分析

参考原鸡(G.gallus)OC-116编码基因序列(登录号:NM_204569.1)设计3对引物,特异性地从仙居鸡子宫组织中克隆OC-116编码基因的N端、中段和C端,测序鉴定后通过酶切连接获得家鸡OC-116的全长编码基因。根据本研究的测序结果,初步发现突变概率较高的碱基有:第1233位(A→G)、1336位(C→G)、1358位(T→G)、1391位(T→G)、1491位(T→G)、1754位(G→T)、1841位(T→C)、1843位(C→T)、1983位(C→T)和2057位(T→C);其中第1358,1754,1841,1983和2057位的碱基突变均为同义突变,第1233、1336、1391、1491和1843位是错义突变。而且突变碱基主要属于T:G颠换类型,其次是T:C转换类型。另外根据同源性分析,家鸡的OC-116编码基因在进化过程中很保守。总之,本研究已经从仙居鸡子宫组织中克隆到OC-116编码基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础。

山麻鸭OC-116基因克隆、生物信息学及组织表达谱分析

实验旨在探究OC-116(Ovocleidin-116)基因在山麻鸭蛋壳形成过程中的作用,应用SMART-RACE技术克隆获得了长度为2129 bp的山麻鸭OC-116基因cDNA全长序列,运用生物信息学软件对该基因和蛋白的特征进行分析,结果显示:该基因编码蛋白的分子式为C2710H4331N865O927S12,属于不稳定蛋白,其编码的蛋白中甘氨酸(16.5%)、丙氨酸(11%)、丝氨酸(10.2%)含量较高。蛋白的二级结构中,α螺旋(Hh)占比0.47%、β折叠(Ee)占比17.64%、无规卷曲(Cc)占比81.89%,且包含肽信号,不含跨膜结构;系统进化树显示山麻鸭与绿头鸭、黑天鹅和棕硬尾鸭的亲缘关系最近;在mRNA的水平上,OC-116基因在山麻鸭14种组织中均有不同程度的表达,其中在垂体、子宫部和峡部中的表达量极显著高于其他组织。子宫部和峡部分别是蛋壳矿化形成和蛋壳膜形成部位,表明OC-116基因在山麻鸭蛋壳的形成过程中扮演着重要的角色。

OC-116基因表达载体构建及其对鸡子宫上皮细胞Ca^(2+)浓度和脂质指标的影响

本研究旨在探究OC-116基因过表达对长顺绿壳蛋鸡子宫上皮细胞Ca^(2+)浓度和脂质指标的影响。构建pcDNA3.1(+)+OC-116+Flag表达载体并转染至分离培养的鸡子宫上皮细胞中,通过Flag标签检测试剂盒检测OC-116基因的过表达量,用Fluo-3/AM钙离子荧光标记法检测Ca^(2+)浓度,用脂质指标试剂盒检测细胞内的脂质含量。结果显示:OC-116基因过表达量与Ca^(2+)呈显著正相关,与高密度脂蛋白胆固醇(HDL)呈极显著正相关,与总胆固醇(TCHO)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL)呈显著负相关;Ca^(2+)与HDL呈极显著正相关,LDL与HDL呈极显著负相关。本研究结果揭示了OC-116基因能调控鸡子宫上皮细胞的Ca^(2+)浓度和脂质的代谢,为深入阐释鸡子宫上皮细胞中钙和脂质的分泌路径提供理论基础。

长顺绿壳蛋鸡OC–116基因变异对蛋壳品质的影响

以长顺绿壳蛋鸡为试验对象,采用PCR产物直接测序法,对OC-116基因g.45670562—g.45670994和g.45669431—g.45670163区域进行单核苷酸多态性筛查;运用一般线性模型,分析多态位点对长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质的遗传效应。结果显示:OC-116基因存在4个SNP位点,分别为位于第2外显子上的g.45668081 G>T、第3外显子上的g.45669143 T>C、第3内含子上的g.45669061 A>G和g.45669101 T>A,g.45668081 G>T和g.45669143 T>C为同义突变,4个SNP位点均表现为中度多态;卡方(χ2)检验表明,4个SNP位点的基因型分布均未偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05);关联性分析结果表明,g.45669061 A>G位点的AA和AG基因型的蛋壳厚度显著高于GG基因型的(P<0.05),g.45669143 T>C位点的TT和CT基因型的蛋壳强度和蛋壳厚度显著高于CC基因型的(P<0.05),揭示g.45669061 A>G和g.45669143 T>C位点可作为蛋壳性状选择的标记性位点。

鸡OC-116基因编码区真核表达载体的筛选及其Real-time PCR检测体系的优化

实验旨在比较鸡OC-116基因编码区在不同载体上的表达差异,筛选表达量相对较高的重组质粒,同时优化OC-116基因编码区的Real-timePCR体系;制备OC116-GFP、OC116-pcDNA、OC116(M1)-pcDNA和OC116(M1)-GFP4种质粒,分别转染CHO细胞,瞬时表达后制备cDNA、提取总蛋白;然后优化OC-116基因编码区的Real-time PCR体系,并分别通过Real-time PCR、Western blotting鉴定表达水平相对更高的重组质粒。结果表明:优化PCR产物中GC碱基的分布可以排除Real-time PCR反应中熔解曲线双峰问题;更换其他实验空间可以有效解决Real-time PCR反应中的疑似气溶胶污染;pcDNA3.1/myc-His(-)A表达载体诱导OC-116基因编码区翻译表达的能力比pEGFP-N1强;在两类真核表达质粒中,Kozak序列的引入均能明显增强OC-116基因编码区的转录以及翻译水平。结果提示,Real-time PCR反应中双峰熔解曲线以及气溶胶污染可以通过引物设计、更换实验环境进行解决;携带Kozak序列的OC-116(M1)-pcDNA重组质粒目标基因转录、翻译表达水平相对更高,可用于后续研究。

蛋鸡不同产蛋期生殖器官中OC17,OC116和OCX32 mRNA相对定量研究

Ovocleidin-17(OC17),Ovocleidin-116(OC116)和Ovocalyxin-32(OCX32)是蛋壳中的特异性基质蛋白,对蛋壳的钙化有重要的调节作用。本试验采用RT-PCR、RT-QPCR分别检测了蛋鸡在产蛋初期、高峰期和后期的卵巢、输卵管的伞部、膨大部、峡部以及子宫部OC17、OC116和OCX32的表达量变化。结果显示:在不同产蛋期3个基因在输卵管峡部和子宫部的表达量均显著或极显著(P<0.05或P<0.01)高于其他组织;卵巢和输卵管中OC17、OC116和OCX32在产蛋高峰期,初期和后期的表达量变化存在显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01);3个产蛋期OCX32在5个组织中的表达量均极显著高于OC17和OC116(P<0.01)。研究结果揭示了蛋壳特异性基质蛋白基因OC17、OC116和OCX32在不同产蛋期蛋鸡生殖器官中的表达规律,为蛋壳形成的分子机理研究提供了理论依据。