用PCR方法快速检测用拉米夫定治疗的乙型肝炎病人中HBV P基因区codon 550的变异

目的 建立一种快速特异的乙型肝炎病毒 (HBV)YMDD变异的检测方法。方法 针对HBVcodon 5 5 0位置设计 2条高度特异的的引物 ,用PCR方法进行DNA扩增。根据电泳结果可分析下列 2种情况 :(1)A741G变异型(YVDD) ;(2 )G743T变异型 (YIDD)。用该方法对 32例病人在拉米夫定治疗前 (0周 ) ,治疗中 (5 2周和 10 4周 )共 6 1份血清进行YMDD变异检测。结果 特异性 :10例病人分别做 0周和 5 2周标本codon 5 5 0特异性PCR和DNA测序。 0周血清检测结果全部为野生型 ,5 2周血清中 5例为A741G ,2例为G743T ,两种方法的检测结果完全相同。敏感性 :6 1份血清中 2例血清PCR未能检出阳性 ,codon 5 5 0变异为 2 9份 ,野生型为 30份 ,和葛兰素威康公司检测结果的符合率为98.3 %。混合变异株检测 3例病人 10 4周血清用PCR测定发现同时存在A741G和G743T两种变异株 ,其中 2例结果经多克隆测序的方法得到确证。结论 HBVcodon 5 5 0特异性PCR方法具有快速、简便和经济实用的优点 ,适用于临床拉米夫定治疗病人HBVYMDD变异的跟踪测定。

子宫内膜异位症不同r-AFS分期患者血清Furin,TGF-β,VEGF,netrin-1水平表达及Furin基因P1启动区r2071410 C/T位点多态性分析

目的了解子宫内膜异位症(endometriosis,EMT)不同r-AFS分期患者血清弗林蛋白酶(Furin)、肿瘤生长因子-β(tumor growth factor-β,TGF-β)、血管生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及神经轴突导向因子-1(neuron towards axon guidance factor-1,netrin-1)水平表达及Furin基因P1启动区r2071410 C/T位点多态性,探讨其与深圳地区EMT发病的相关性。方法选取2021年5月~2023年1月深圳市龙华区人民医院确诊的EMT患者102例为EMT组,并根据r-AFs分期法将EMT组分为I~II期和III~IV期。同时收集同期非EMT患者78例为对照组。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清Furin,TGF-β,VEGF及netrin-1水平,并采用反转录-实时荧光定量聚合酶链反应法(reverse transcription-real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)分析Furin基因P1启动区r2071410 C/T位点多态性。结果EMT组患者血清Furin(140.84±47.02pg/ml),TGF-β(376.46±82.36ng/L)和VEGF水平(167.67±53.02ng/L)明显高于对照组(55.49±13.67pg/ml,216.37±15.04ng/L,102.27±8.45ng/L),而netrin-1水平(48.37±15.20pg/ml)明显低于对照组(165.85±15.63pg/ml),差异具有统计学意义(t=28.409,20.347,16.915,36.653,均P<0.05)。III~IV期患者血清Furin(192.41±20.62pg/ml),TGF-β(452.61±72.03ng/L)和VEGF水平(201.84±28.01ng/L)明显高于I~II期(78.05±16.54pg/ml,283.75±56.92ng/L,126.07±19.35ng/L),而netrin-1水平(37.95±11.34pg/ml)明显低于I~II期(61.05±9.52pg/ml),差异有统计学意义(t=31.071,18.054,19.183,21.625,均P<0.05)。经Pearson/Spearman相关性分析结果显示,Furin与TGF-β,VEGF水平及临床分期呈正相关(r=0.6149,0.7526,0.7905,均P<0.05),而与netrin-1水平呈负相关(r=-0.6701,均P<0.05)。EMT组患者Furin基因P1启动区r2071410 C/T位点TT基因型和T等位基因频率(42.16%,55.39%)明显高于对照组(7.69%,19.87%),且III~IV期TT基因型和T等位基因频率(51.79%,65.18%)比I~II期(30.43%,43.48%)明显升高,差异具有统计学意义(χ^(2)=26.500,46.472,4.721,9.626,均P<0.05)。EMT组不同基因型患者血清Furin水平差异具有统计学意义(F=51.286,P<0.001),其中TT基因型患者血清Furin水平(216.29±68.53pg/ml)明显高于CC(83.04±21.37pg/ml)和CT基因型(89.18±20.95pg/ml),差异具有统计学意义(t=27.146,25.719,均P<0.01),但CC与CT基因型之间差异无统计学意义(t=1.326,P>0.05)。结论EMT患者血清Furin水平明显升高,且与TGF-β,VEGF,netrin-1水平及临床分期呈一定相关性;同时Furin基因P1启动区r2071410 C/T位点呈多态性分布,其中TT基因型患者血清Furin水平升高更为明显,可能与深圳地区EMT发病有关。

替比夫定抗病毒治疗不同时间慢性乙型肝炎患者HBV P基因RT区序列突变模式及耐药率的改变

目的:通过研究替比夫定治疗不同时间慢性乙型肝炎患者HBVP基因RT区序列突变模式及耐药率的改变,探讨替比夫定的主要耐药变异模式及耐药率。方法:应用重组克隆测序检测法检测47例接受替比夫定治疗1、2、5年的慢性乙型肝炎患者HBVP基因区序列。结果:应用替比夫定治疗1年者有2例(4.26%)出现常见变异位点,P基因区突变模式均为rtM204I;治疗2年者有10例(21.28%)出现变异位点,9例突变模式为rtM204I,1例突变模式为rtL180M+rtM204I;治疗5年者有24例(51.06%)检测到替比夫定常见变异位点,16例(66.7%)变异模式为rtM204I、4例(16.7%)为rtL180M+rtM204I,另外还有rtL181V+rtM204I、rtM204V、rtM204I+rtN238H、rtL180M+rtM204I+rtD263E各1例。结论:替比夫定的主要耐药变异模式为rtM204I和rtL180M+rtM204I。替比夫定治疗1、2、5年的耐药率分别为4.26%、21.28%和51.06%。提示替比夫定的5年耐药率明显低于拉米夫定的4年耐药率,但替比夫定的耐药率高于阿德福韦酯。

提高乙型肝炎病毒P基因区聚合酶链反应检测阳性率的策略

目的 提高乙型肝炎病毒 (HBV)DNAP基因区聚合酶链反应 (PCR)检测的阳性率。方法 采用优化PCR反应条件 ,降低退火温度以及采用 3′末端碱基游移兼并引物 ,减少引物与模板引物结合区的错配对PCR的影响等多种方法 ,对常规PCR检测HBVDNAP基因区阴性的病人血清 ,再进行PCR检测。结果 通过降低退火温度及减少 3′末端错配 ,PCR检测阳性率由 81 7% ( 6 7/ 82 )增加至 92 7% ( 76 / 82 ,P <0 0 5 )。结论 综合采用优化PCR反应条件 ,降低退火温度和采用 3′末端碱基游移兼并引物等方法 ,可提高基因高突变区PCR检测阳性率。

SNaPshot技术检测乙型肝炎病毒基因组P基因区单核苷酸多态性的研究

目的 建立SNaPshot技术对乙型肝炎病毒(HBV)基因组P基因区单核苷酸多态性(SNP)的分析。方法 针对HBVYMDD变异位置的上、下游设计引物,用PCR方法进行DNA扩增,产物直接测序或克隆测序。再针对变异位点74 1A G变异型(YVDD)和74 3G T变异型(YIDD)的紧邻上游设计高度特异的SNaPshot检测引物,用不同荧光标记的ddNTP对PCR产物进行一步延伸,然后置于310型DNA测序仪上观察荧光信号,可直观的检测上述两位点的单核苷酸多态性。结果 在拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者中,经测序证实P基因区不仅存在74 1、74 3位点的变异,还存在5 14C A、5 2 3C A、5 6 2T A、6 6 7C A等位点的变异。对已证实P基因区变异的13例患者血清用SNaPshot技术检测YMDD结果与测序结果完全相同,显示SNaPshot技术高度的特异性。结论 SNaPshot技术检测HBV基因组SNPs具有快速、简便、准确特异的特点,还检测到野生株和变异株的混合存在。

新城疫病毒V4株NP和P基因及其间隔区序列的克隆与分析

采用RT-PCR技术克隆了新城疫病毒(NDV)V4株长约4 200 bp的核苷酸序列,并进行了序列测定与分析。结果表明,该序列中包含有NDV V4株NP基因编码区、NP和P基因间隔区以及P基因的全部核苷酸序列。NDV V4株NP和P基因与其他8个NDV毒株相应部分进行同源性比较,与Quuesland V4株的同源性最高。NDV V4株NP和P基因间隔区序列与其他13株NDV毒株相应部分的比较结果表明,F48E9等强毒株较La sota等弱毒、无毒毒株和试验用V4株在这个区域多了6个碱基,这6个碱基插入的位置在La sota等弱毒、无毒毒株全基因组序列的1647-1648 nt处;参比的14株NDV在这个区域的同源性为63．9％-100％,弱毒株之间的同源性较高,弱毒株与强毒株之间及强毒株之间的同源性差异较大。

HBV多聚酶基因P区单位点和多位点突变、低中高HBV DNA载量、轻中重度的CHB患者外周血T淋巴细胞亚群观察

目的观察乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶基因逆转录保守区(P区)单位点和多位点突变、低中高HBV DNA载量、轻中重度的慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血T淋巴细胞亚群变化。方法CHB患者61例,采用基因测序确认HBV多聚酶基因P区位点突变,另取30例健康人群作对照,比较CHB患者HBV多聚酶基因P区位点突变前后及对照组CD3^(+)、CD4^(+)、CD8;T淋巴细胞变化。61例CHB患者又根据发生P区耐药基因突变的位点个数分为单位点者(29例)和多位点者(32例),根据HBV DNA载量分为低拷贝者(6例)、中拷贝者(22例)、高拷贝者(33例),根据病情程度分为轻度者(12例)、中度者(25例)、重度者(24例),比较其外周血CD3^(+)、CD4^(+)、CD8;T淋巴细胞变化。结果与健康人群比较,CHB患者发生HBV耐药基因突变后CD3^(+)、CD4^(+)、CD8;T淋巴细胞均降低(P均<0.05);与突变前比较,CHB患者突变后CD3^(+)、CD4^(+)T淋巴细胞降低(P均<0.05)。不同位点CHB患者CD3^(+)、CD4^(+)、CD8;T淋巴细胞比较均无显著性差异(P均>0.05)。不同HBV DNA载量CHB患者CD3^(+)、CD4^(+)、CD8;T淋巴细胞比较均无统计学差异(P均>0.05)。与中度者比较,重度者CD3^(+)、CD8;T淋巴细胞降低(P均<0.05)。结论CHB患者体内病毒发生耐药基因突变后,外周血CD3^(+)、CD4^(+)T淋巴细胞消耗增多;随耐药基因突变位点增多,HBV DNA载量不断增高,患者CD3^(+)、CD4^(+)、CD8;T淋巴细胞均呈消耗增多趋势。随病情加重,患者CD3^(+)、CD4^(+)T淋巴细胞消耗不断增多,尤其病情严重期,患者CD8;T淋巴细胞消耗亦增多。

亚洲1型口蹄疫病毒RS株非结构蛋白P3区基因特征分析

经RT-PCR扩增得到一株口蹄疫亚洲1型流行毒株的非结构蛋白P3基因核苷酸序列,与其他代表性参考毒株的P3基因进行比较,分析该毒株P3区基因特征。结果表明,该毒株P3基因含有2721个核苷酸,编码907个氨基酸;其中非结构蛋白3A的基因长度为459bp,编码153个氨基酸;3个3B(VPg)基因长度分别是69、72、72bp,分别编码23、24、24个氨基酸;3C基因长度为639bp,编码213个氨基酸;3D基因长度为1410bp,编码470个氨基酸。氨基酸序列比较分析显示,3A基因C末端比其他基因更容易变异,根据3A基因构建的系统进化分析提示该流行毒株与YNBS/58和IND 321/01亲缘关系较近,属同一亚系谱。

广西陆川猪猪肺炎支原体P97基因R1区克隆及序列分析

本试验通过深入了解广西陆川猪猪肺炎支原体（Mhp）地方流行毒株的黏附因子P97基因R1区的序列特征、基本结构及遗传变异等特点,为广西地方品种陆川猪猪支原体肺炎（MPS）有效的综合防控措施提供理论依据,并为进一步研究广西陆川猪Mhp地方流行毒株特性打下坚实的基础。参考Mhp基因组序列设计扩增P97基因R1区的1对引物,以2011年—2014年广西陆川猪MPS阳性病料为研究对象,提取基因组DNA,PCR扩增P97基因R1区,对PCR产物进行测序,将广西陆川猪Mhp不同地方流行毒株的P97基因R1区序列的碱基组成和推导的氨基酸序列进行比对。DNAStar软件分析结果表明,所获得的15株广西陆川猪Mhp毒株（GXLC-1、GXLC-2、GXLC-3、GXLC-4、GXLC-5、GXLC-6、GXLC-7、GXLC-8、GXLC-9、GXLC-10、GXLC-11、GXLC-12、GXLC-13、GXLC-14、GXLC-15）和3株广西其他品种猪Mhp毒株（GX227、GX595、GX674）的P97基因R1区的多处碱基发生变异。通过推导氨基酸序列统计P97R1区五氨基酸（AAKPV/E）重复数为9~18,平均值为12,TN重复数为1~4,结果发现广西陆川猪Mhp流行毒株变异使其毒力和黏附能力增强,再加上陆川猪呼吸道短小狭窄的特殊结构,更易导致广西陆川猪MPS的发生。

山西地区61例乙型肝炎病毒耐药变异与基因型检测研究分析

目的通过对山西省乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）P区基因测序的研究，探讨HBV基因变异位点及基因分型的分布规律。方法采集61例HBV患者血清标本，采用双脱氧末端终止法对待检标本P区进行基因序列检测，用Chromas 2．23软件对测序结果进行分析，通过在NCBI网站进行序列比对，并进行基因分型。结果53例受检患者均检测出P区的碱基以及氨基酸序列图，其中，有28例（52．8％）发生突变，突变位点分别有rt204、rt180、rt236、rt173、rt181、n214、rt250、rt213、rt184、rt237；各突变的位点中，以rt204和rt180位点的突变比例最高，分别占67．9％和53．5％。2例为B基因型，阳性率为3．8％，其余51例均为C基因型，阳性率为96.2％。结论山西省地区HBV分布以C基因型多见；发生变异的HBV病毒株中，10个变异位点均有涉及，但是仍以rt204位点突变为主，伴随其他位点突变，提示rt204位点可能存在顺式作用元件，在HBVDNA基因转录、翻译中起到调控作用。

肺癌患者血清p16基因甲基化检测意义

肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，肺癌的早期诊断对其治疗效果十分重要。p16基因是一种重要的抑癌基因，研究肺癌中p16基因启动子区CpG岛甲基化的发生状态具有很大的临床意义。用于检测CpG岛甲基化的特异聚合酶链反应（methylation specific PCR，MSP）方法，为DNA甲基化的研究提供了新手段。本文采用MSP技术检测肺癌患者全血中p16基因的甲基化情况，探讨其与肺癌发生发展的关系和作为肺癌早期诊断指标的可能性，现报道如下：

胃癌手术前后血浆中p16基因的异常甲基化检测

目的:研究胃癌患者手术前后外周血浆、对应原发肿瘤以及癌旁组织中p16基因启动子区异常甲基化的检出状况,探讨其在胃癌疗效评估中的应用.方法:采用甲基化特异性PGR方法,扩增84例胃癌患者的原发肿瘤、癌旁组织、手术前血浆中pl6基因启动子区,以及上述患者中30例行胃癌根治性手术患者术后14～21天血浆中p16基因启动子区,以15例健康人血浆作为正常对照.采用凝胶电泳-溴乙锭显色以及高效液相色谱两种方法检测产物.结果:84例患者样品中,原发肿瘤中存在pl6基因异常甲基化26例(31.0%),癌旁组织中阳性2例(0.02%),术前血浆中阳性12例(14.3%),15例健康人血浆检测均为阴性.患者血浆阳性者同时也存在对应肿瘤组织阳性.30例同时有手术前后血浆标本的胃癌根治手术患者中,原发肿瘤组织中p16异常甲基化14例,其中6例术前血浆阳性,术后5例转阴.在检测样本中,高效液相色谱的检测结果与凝胶电泳-溴乙锭显色结果一致.结论:胃癌患者外周血浆中可以检测到与原发肿瘤一致的p16异常甲基化,手术后血浆中p16甲基化状态的变化与手术治疗有关,高效液相色谱作为一种便捷的技术可以应用于PCR产物的检测.

P16基因启动子区CpG岛甲基化与脑肿瘤的相关性研究

一、材料与方法 58例脑肿瘤组织来自本院神经外科手术标本，均经病理证实。男19例，女39例，年龄21～76岁。脑肿瘤组织按WHO中枢神经系统恶性肿瘤病理分类及分级标准进行诊断：胶质瘤26例（低恶度胶质瘤10例；高恶度胶质瘤16例），垂体瘤16例，脑膜瘤13例，转移瘤3例。术前采集静脉血2ml，分离血浆备用。同时选取10名健康人员作对照，男4名，女6名，抽取防凝静脉血2ml，分离血浆和提取白细胞备检。灭菌去离子水作空白对照。

胰腺癌组织中p16基因启动子区5′CpG岛甲基化及其表达研究

在胰腺癌多步骤、多阶段发生过程中有多种肿瘤相关基因参与。p16基因是其中一个重要的抑癌基因，参与细胞周期的调控，控制细胞的生长和分化。大量研究表明，多种肿瘤细胞中p16基因通过突变、缺失、高甲基化等方式失活，造成p16蛋白功能丧失，从而导致肿瘤细胞恶性生长。免疫组化研究发现，胰腺癌组织中p16蛋白失表达的比例很高，而关于胰腺原发瘤中p16基因甲基化改变及其临床病理意义的研究报道少见，本研究旨在探讨胰腺癌组织中p16基因启动子区5’CpG岛甲基化情况及其与P16蛋白表达的关系和临床意义，研究其在胰腺癌发生中的可能机制。

乙型肝炎病毒前C/CP基因启动子变异特征

乙型肝炎病毒（HBV）在肝癌的发生发展过程中占有十分重要的地位。有研究表明，乙型肝炎病毒HBsAg携带者患肝癌的危险性比HBsAg阴性者高217倍。HBV基因组主要包括四个开放读码框架（ORF），其中C区编码HBcAg及HBeAg，其调控序列位于前C区及C基因启动子（CP）。HBV前C／CP区变异可以通过阻止或减少HBeAg合成和分泌来影响宿主的免疫应答。近年来研究表明，HBV基因变异与肝癌病程有关H0。为深入了解HBV的致癌机制，我们收集浙江省HBsAg阳性肝癌患者血清，测定HBV前C／CP区核苷酸序列，以探明乙肝相关性肝癌患者HBV前C／CP基因区变异的临床意义。

p16基因甲基化与反流性食管炎和食管鳞癌相关性研究

目前反流性食管炎（RE）发生率逐年增高，已成为我国临床上的多发病和常见病。本文对10例正常食管组织，50例RE组织和9例食管鳞癌组织中p16基因启动子区甲基化状态进行对照检测，以探讨反流性食管炎和食管鳞癌间的可能相关性。