尼罗罗非鱼钙结合蛋白S100P基因的克隆及功能分析

为探究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)钙结合蛋白S100P基因(On S100P)的功能,根据从罗非鱼头肾转录组获得的On S100P序列设计特异性引物,克隆得到On S100P,并对其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析,利用荧光定量PCR技术,研究其在不同组织中的定位和表达水平及Poly(I∶C)刺激后该基因在各个组织中的表达模式,并表达与制备了重组蛋白,用于孵育尼罗罗非鱼头、肾、淋巴细胞后研究其对炎症因子转录的调控作用。结果表明:On S100P基因CDS长度为288 bp,可编码96个氨基酸,含有S100蛋白家族的保守结构域;系统进化树结果分析表明,尼罗罗非鱼同斑马丽鱼(Maylandia zebra)的S100P具有较高的同源性;组织分布分析显示,On S100P在尼罗罗非鱼的不同组织中均有表达,其中以肌肉和鳃的表达量最高;经Poly(I∶C)刺激后,罗非鱼肠道、头肾和脑组织中On S100P表达水平显著升高且刺激24 h后达到高峰;制备的On S100P重组蛋白(rOn S100P)可诱导肾淋巴细胞MIF、IL8、TNF-β及IL1-β的表达。研究表明,On S100P氨基酸序列具有S100保守结构域,与其他S100蛋白家族成员类似,可通过调节淋巴细胞炎症因子的表达影响鱼类的免疫应答。

USP7-MDM2-p53信号轴对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

目的:探讨泛素特异性蛋白酶7(USP7)调节Mdm2 p53结合蛋白同源物(MDM2)-p53轴对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法:Western blot检测人子宫内膜癌组织、癌旁组织、人子宫内膜上皮细胞hEEC及人子宫内膜癌细胞系Ishikawa、HEC-1-A、KLE中USP7蛋白表达。将Ishikawa细胞分为NC组、P22077(USP7抑制剂)组、pcDNA组、pcDNA-MDM2组、P22077+pcDNA组、P22077+pcDNA-MDM2组,CCK-8法和克隆形成实验检测Ishikawa细胞增殖;流式细胞术检测Ishikawa细胞凋亡与细胞周期变化;Western blot检测Ishikawa细胞中USP7、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、周期素依赖性激酶2(CDK2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、MDM2、p53蛋白表达。以RG7388(MDM2抑制剂)或PFT-α(p53抑制剂)与20μmol/L P22077共处理Ishikawa细胞48 h以验证USP7-MDM2-p53信号轴上下游关系。结果:USP7蛋白在子宫内膜癌组织和细胞中高表达,且Ishikawa细胞中USP7蛋白表达量最高,因此,选择Ishikawa细胞为研究对象。与NC组比较,P22077组Ishikawa细胞OD 450值、克隆形成率、S期和G 2/M期细胞数、USP7、CyclinD1、CDK2、MDM2蛋白表达降低,细胞凋亡率、G_(0)/G_(1)期细胞数、p53、Bax蛋白表达升高(P<0.05);与NC组、pcDNA组比较,pcDNA-MDM2组Ishikawa细胞OD 450值、克隆形成率、S期和G 2/M期细胞数、USP7、CyclinD1、CDK2、MDM2蛋白表达升高,细胞凋亡率、G_(0)/G_(1)期细胞数、p53、Bax蛋白表达降低(P<0.05);与P22077组、P22077+pcDNA组比较,P22077+pcDNA-MDM2组Ishikawa细胞OD 450值、克隆形成率、S期和G 2/M期细胞数、USP7、CyclinD1、CDK2、MDM2蛋白表达升高,细胞凋亡率、G_(0)/G_(1)期细胞数、p53、Bax蛋白表达降低(P<0.05)。p53为USP7-MDM2通路下游分子。结论:抑制USP7表达可能通过下调MDM2来激活p53进而抑制Ishikawa细胞增殖、促进细胞凋亡及周期停滞。

TP53BP2基因真核表达载体的构建及在人胚肾Expi293F细胞中蛋白表达、纯化及活性鉴定

目的构建人肿瘤抑制因子p53结合蛋白2(tumor suppressor p53-binding protein 2,TP53BP2)的重组真核表达载体,转染人胚肾Expi293F细胞,获得高纯度的重组人全长TP53BP2蛋白并对其进行生物学活性鉴定。方法利用UniProt网站查询TP53BP2基因序列,并进行Expi293F表达系统序列优化,通过同源重组连接至pcDNA3.1(+)-P2Ae GFP载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pcDNA3.1(+)-P2A-eGFPTP53BP2质粒瞬时转染至Expi293F细胞,荧光显微镜观察转染效率,收集实验组及对照组细胞,利用免疫印记试验(Western blot,WB)检测TP53BP2重组蛋白表达水平。通过His标签纯化试剂盒及Superdex 20010/300GL层析柱进行蛋白纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)对纯化后重组蛋白进行鉴定。利用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测重组人全长TP53BP2蛋白与p65蛋白结合情况。利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测重组人全长TP53BP2蛋白与p65蛋白共定位。利用表面等离子体共振(surface-plasmon resonance,SPR)技术,检测纯化后的重组人全长TP53BP2蛋白与TP53BP2抗体的相互作用。结果经测序和双酶切鉴定,重组质粒pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP-TP53BP2构建成功。经荧光显微镜观察结果显示转染效率约为60%,WB结果表明TP53BP2蛋白在Expi293F细胞中过表达,证明转染成功。SDS-PAGE结果表明纯化后重组蛋白纯度在90%以上,证明纯化成功。Co-IP结果表明,TP53BP2重组蛋白可与p65蛋白相互作用。IF结果表明,His标签蛋白、TP53BP2蛋白及p65蛋白存在共定位,表明三者之间存在相互作用。SPR结果表明,纯化的重组人TP53BP蛋白与TP53BP2抗体具有较好的结合活性。以上结果均证明重组人全长TP53BP2蛋白具有生物学活性。结论成功构建了TP53BP2基因真核表达载体并在人胚肾Expi293F细胞中成功表达出具有生物学活性的重组人全长TP53BP2蛋白,为进一步研究TP53BP2的结构和功能奠定了基础。

组蛋白修饰调控53BP1与染色质结合功能的研究进展

p53结合蛋白1(p53-binding protein 1,53BP1)在协调DNA双链断裂(DNA double strand break,DSB)修复途径选择中起关键作用。关于53BP1募集到受损染色质中的基本分子机制,以及组蛋白修饰在53BP1募集中的作用,已有大量文献报道了全新的见解。H4K20me2和H2AK15ub是决定53BP1能否结合到受损染色质中的关键因素。最新证据表明,H3K18、H3K56乙酰化及H4K16乙酰化/甲基化对53BP1募集均有一定程度的影响。文章对53BP1的结构、53BP1募集的分子机制和组蛋白修饰在调节53BP1募集中的作用进行了综述,并为癌症治疗提供新的思路。

2型糖尿病周围神经病变患者血清S100钙结合蛋白B、P的表达及临床意义

目的研究2型糖尿病(T2DM)合并周围神经病变(DPN)患者血清S100钙结合蛋白B(S100B)、血清S100钙结合蛋白P(S100P)的表达及临床意义。方法将2019年1月至2021年1月该院收治的152例T2DM患者作为研究对象,根据是否合并DPN分为非DPN组(98例)和DPN组(54例)。比较两组血清S100B、S100P水平,以及一般临床资料及神经传导速度的差异。采用Pearson法进行相关性分析,多因素Logistic回归模型分析影响DPN发生的危险因素,受试者工作特征(ROC)曲线分析S100B、S100P检测对DPN的诊断价值。结果DPN组血清S100B、S100P,以及糖尿病病程、空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)均高于或长于非DPN组,差异有统计学意义(P<0.05),而正中神经运动(MMCV)和感觉(MSCV)传导速度、尺神经运动(UMCV)和感觉(USCV)传导速度、腓总神经运动(PMCV)和感觉(PSCV)传导速度低于非DPN组,差异有统计学意义(P<0.05)。DPN组患者血清S100B、S100P与FPG、HbA1c水平呈显著正相关(r=0.618~0.737,均P<0.05),与MMCV、UMCV、MSCV、PSCV呈显著负相关(r=-0.657~-0.874,均P<0.05)。糖尿病病程(OR=1.236,P<0.001)、HbA1c(OR=1.300,P<0.001)、S100B(OR=1.370,P<0.001)和S100P(OR=1.361,P<0.001)均是影响T2DM患者DPN发生的独立危险因素,血清S100B、S100P检测对T2DM患者DPN诊断的曲线下面积为0.724、0.728。结论T2DM合并DPN患者血清S100B、S100P水平升高,是影响T2DM患者DPN发生的独立危险因素。

UbcH7及53BP1基因在结直肠癌中的表达及意义

目的 探讨结直肠癌中泛素交联酶L3(UbcH7)和p53结合蛋白1(53BP1)的表达及其临床意义。方法选择2018年1月至2020年1月收治的98例结直肠癌患者为研究对象,采用实时荧光定量PCR(qRTPCR)法检测结直肠癌肿瘤组织和癌旁正常组织UbcH7及53BP1基因mRNA表达。采用免疫组织化学法(SP法)检测UbcH7及53BP1基因蛋白表达。采用Pearson和Spearman法分析结直肠肿瘤组织UbcH7、53BP1基因mRNA及蛋白表达相关性。绘制ROC曲线分析结直肠肿瘤组织UbcH7和53BP1基因mRNA表达在3年生存期中的预测效能。Kaplan-Meier法分析结直肠肿瘤组织UbcH7和53BP1基因蛋白表达与3年生存率的关系。结果 结直肠肿瘤组织中UbcH7基因mRNA表达及蛋白阳性率均高于癌旁正常组织,53BP1基因mRNA表达及蛋白阳性率均低于癌旁正常组织(均P<0.05)。结直肠肿瘤组织中UbcH7和53BP1基因mRNA表达、蛋白表达均呈负相关(r=-0.626、-0.795,均P<0.05)。Ⅲ+Ⅳ期、N1+N2淋巴结转移的结直肠癌患者UbcH7蛋白表达阳性率、53BP1蛋白表达阴性率均高于Ⅰ+Ⅱ期、N0淋巴结转移的结直肠癌患者(均P <0.05)。UbcH7基因mRNA预测3年生存期的截断值为1.17,敏感度为0.789,特异度为0.824,曲线下面积(AUC)为0.726;53BP1基因mRNA预测3年生存期的截断值为0.73,敏感度为0.815,特异度为0.791,AUC为0.804。UbcH7阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者(P<0.05),53BP1阳性表达患者3年生存率高于阴性表达患者(P <0.05)。结论 结直肠肿瘤组织中UbcH7表达水平升高,53BP1表达水平降低。与TNM分期、淋巴结转移及3年生存率密切相关,可作为结直肠癌患者病情及预后评估的标志物。

LncRNA FGD5-AS1靶向miR-16-5p/CREB1轴减轻缺氧/复氧诱导大鼠H9c2心肌细胞凋亡的机制研究

目的:探究长链非编码RNA(LncRNA)FGD5反义RNA1(FGD5-AS1)对缺氧/复氧(H/R)诱导的大鼠H9c2心肌细胞凋亡的影响以及对微小RNA-16-5p/cAMP响应元件结合蛋白1(miR-16-5p/CREB1)轴的调节机制。方法:将H9c2细胞分为对照组和H/R组(缺氧6 h,复氧6 h),然后将H/R组细胞分别进行转染,分为oe-NC组、oe-FGD5-AS1组、oe-FGD5-AS1+miR-16-5p mimic-NC组、oe-FGD5-AS1+miR-16-5p mimic组。实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应法(RT-qPCR)检测细胞中FGD5-AS1、miR-16-5p、CREB1的mRNA水平;蛋白免疫印迹(Western Blot)法测定裂解凋亡蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达;CCK-8法测定细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶活性实验分别验证miR-16-5p和FGD5-AS1、CREB1的靶向关系。结果:与对照组比较,H/R组细胞中FGD5-AS1和CREB1的mRNA水平、细胞存活率、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05),miR-16-5p mRNA水平、细胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达升高(P<0.05);与H/R组和oe-NC组比较,转染过表达FGD5-AS1基因的H9c2细胞中FGD5-AS1和CREB1的mRNA水平、细胞存活率、Bcl-2蛋白表达增高,凋亡率及miR-16-5p、cleaved Caspase-3、Bax水平下降(P<0.05)。双荧光素酶活性实验验证了FGD5-AS1、CREB1均与miR-16-5p有结合位点。结论:过表达FGD5-AS1可能通过靶向下调miR-16-5p表达,上调CREB1表达,抑制H/R诱导的H9c2心肌细胞凋亡。

DNA损伤检测点介质1和p53结合蛋白1在人食管癌细胞系TE-1.TE-13.Eca109中的表达及意义

目的研究DNA损伤检测点介质1(MDC1)和p53结合蛋白1(53BP1)在人食管癌细胞系中的表达及意义。方法采用半定量RT-PCR、免疫细胞化学法、间接免疫荧光法和Western blotting检测MDC1、53BP1mRNA和蛋白在人食管癌细胞系TE-1.TE-13.Eca109的表达水平。结果RT-PCR结果显示MDC1、53BP1mRNA在所检测的人食管癌细胞系中均有表达;免疫细胞化学法、间接免疫荧光法和Western blotting均在人食管癌细胞系中检测到MDC1、53BP1的蛋白表达。结论首次证实了MDC1、53BP1在食管癌细胞系中的表达,推测MDC1、53BP1可能和食管癌细胞的放射敏感性有关。

P53结合位点对人NOD8基因的调控

目的:探讨P53结合位点在NOD8基因调控中的作用。方法:利用生物信息学方法,我们发现人与黑猩猩的NOD8基因核心启动子区域相似位置含有P53结合位点;以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD8基因序列,构建含有/缺失人P53结合位点的NOD8基因启动子驱动的、表达绿色荧光蛋白-NOD8融合蛋白的质粒pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8和mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8;将构建的重组质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导瞬时转染HEK293细胞中,并加入不同浓度的P53抑制剂pifithrin alpha(PFT-α)处理HEK293细胞,用RT-PCR和Westren blotting方法检测NOD8 mRNA和蛋白的表达;此外,用pNOD8(760 bp)-EGFP质粒转染HEK293细胞,利用染色质免疫共沉淀法(ChIP)观察P53是否与NOD8启动子结合。结果:经酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功。ChIP实验证实P53能与NOD8启动子结合。pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8转染组中NOD8 mRNA的表达显著高于pEGFP-C2转染组(P<0.05),并且NOD8 mRNA在缺失人P53结合位点的mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8转染组中的表达明显降低(P<0.01);同时发现加入PFT-α的pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8转染组NOD8 mRNA的表达显著下降,并呈剂量依赖关系,其中90μmol/L PFT-α对NOD8mRNA表达的抑制作用最为显著(P<0.01)。与mRNA检测结果一致的是pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8转染组NOD8蛋白的表达量显著高于对照组pEGFP-C2;而mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8转染组NOD8蛋白的表达量明显低于pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8转染组和加入PFT-α的pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8转染组(P<0.01)。结论:P53结合位点在NOD8基因调控中起着重要的作用,并且P53结合位点与NOD8基因之间可能存在正反馈调节。

S100钙结合蛋白P在胃癌患者胃癌组织和血清中的表达及其临床意义

目的:研究胃癌患者胃癌组织和血清中S100钙结合蛋白P(S100P)表达及其与临床病理参数的关系,监测原发肿瘤切除前后血清S100P蛋白水平,探讨其与预后的关系。方法:选取手术切除并经病理检查确诊的胃癌患者50例作为研究对象,所有患者均可获取术后石蜡组织标本及术前血清,其中20例患者可获取新鲜胃癌组织及配对癌旁组织,另30例患者可获取术后动态血清。半定量RT-PCR法检测组织中S100P mRNA水平;免疫组织化学法及ELISA法分别检测组织和血清中S100P蛋白水平。选择同期30名体检者为正常对照组,ELISA法检测血清S100P蛋白水平。结果:胃癌组织S100P mRNA表达水平明显低于癌旁组织(P<0.05);胃癌组织S100P蛋白阳性表达率低于癌旁组织(P<0.05),S100P表达下调与脉管癌栓有关联(P<0.05)。胃癌患者术前血清S100P水平低于正常对照组,但差异无统计学意义(P>0.05);无淋巴结转移胃癌患者血清S100P水平高于有淋巴结转移患者,但差异无统计学意义(P>0.05);胃癌患者手术后2周血清S100P水平明显低于手术前(P<0.05)。结论:S100P在胃癌患者胃癌组织和血清中表达水平下调,其表达水平与预后有关联。持续动态监测血清S100P水平变化可能预测复发及判断预后。

p53-MDM2结合抑制剂药效团模型的构建

采用Catalyst软件,选择5类共24个p53-MDM2结合抑制剂作为训练集,经计算机建模、构象优化。由Catalyst系统构建出药效团模型,并对药效团进行有效性分析,结合已知的p53-MDM2结合抑制剂的结构信息,筛选得到含有一个芳环中心、三个疏水中心和一个氢键受体的具有较好预测能力(Correl=0.941,Config= 17.530,Δcost=150.830)的药效团模型.

企业市场营销中4P与4C的结合运用

随着市场经济的发展,竞争也在加剧,企业市场营销组合战略的制定,应将4P与4C结合运用。我们可应用4C制定企业市场营销组合的指导思想,应用4P制定企业市场营销组合战略,二者有机结合来创新营销战略和优化营销活动,能提高企业在市场营销中的竞争力。

内毒素结合肽P1和P2抗内毒素活性的实验研究

目的研究基于脂多糖(lipolysachride,LPS)结合蛋白的新型内毒素结合肽P1和P2的抗内毒素活性。方法设计并合成内毒素结合肽P1和P2。体外实验取一名健康志愿者静脉血100ml分离的外周血单个核细胞(PBM),分为正常对照组、LPS组、阳性对照组LPS(1mg/L)+多黏菌素B(12.5mg/L)、P1组LPS(1mg/L)+P1(2mg/L,5mg/L,12.5mg/L)、P2组LPS(1mg/L)+P2(2mg/L,5mg/L,12.5mg/L)。ELISA方法检测各组上清液中TNF-α和IL-6的浓度。体内实验将40只昆明小鼠平均分为四组,每组10只,分别为空白对照组、LPS模型组、LPS+P1治疗组和LPS+P2治疗组。取各组小鼠肺脏和肝脏组织制作HE切片,观察组织形态学变化。结果 (1)与1mg/L LPS比较,1mg/L LPS+12.5mg/L的P1以及1mg/L LPS+3种浓度P2刺激后,PBMC培养上清液中IL-6及TNF-α的水平均明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.01),12.5mg/L的P2与阳性对照PMBC作用后上清液中TNF-α浓度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)组织形态学显示,模型组小鼠肝小叶中央静脉及肝窦扩张充血,肝细胞浊肿,偶见肝细胞嗜酸性变及点状坏死。肺间质充血水肿,灶性出血,肺泡腔狭小。10mg/kg P1处理组肝细胞浊肿较模型组减轻,肺间质充血水肿减轻。10mg/kg P2处理组,肝小叶中央静脉及肝窦充血程度减轻,肺间质充血水肿明显减轻。结论体内外实验表明合成内毒素结合肽P1和P2对LPS导致的机体损伤具有拮抗作用。体外实验结果还表明,12.5mg/L P2对TNF-α或IL-6的释放抑制作用较为肯定。

P53结合蛋白1在宫颈鳞癌中的表达及其临床意义

目的:探讨P53结合蛋白1(53BP1)在宫颈鳞癌组织中的表达情况及其与临床分期、分化程度、淋巴结转移以及病灶大小的关系。方法:选取2010年5月至2011年8月期间在温州医科大学附属第一医院妇科收治的临床资料完整的52例宫颈鳞癌、30例宫颈上皮内瘤变(CIN)和20例正常宫颈组织,采用实时荧光定量PCR技术检测53BP1 mRNA的表达水平,并对其表达水平与临床病理特征的关系进行统计学分析。结果:宫颈鳞癌组织中53BP1 mRNA相对表达水平明显低于正常组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。宫颈鳞癌中高分化组中53BP1 mRNA相对表达水平明显高于宫颈鳞癌低分化组,差异具有统计学意义(P<0.05)。宫颈鳞癌无淋巴结转移组中53BP1 mRNA相对表达水平明显高于宫颈鳞癌淋巴结转移组,差异具有统计学意义(P<0.05)。宫颈鳞癌FIGO I期组和FIGOⅡ期组以及宫颈鳞癌大病灶组和小病灶组间53BP1 mRNA相对表达水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:53BP1在宫颈鳞癌组织中表达减低,与分化程度、淋巴结转移有关,与病灶大小、临床分期无明显相关。

含p53保守结合位点的microRNA表达载体的构建及应用

目的:构建含p53保守结合位点的microRNA(miRNA)表达载体,促进相关miRNA在具有野生型p53蛋白细胞中的高效表达。方法:改构miRNA表达载体pCMV-miR,在其多克隆位点前插入p53保守结合位点,分别将miR-138、miR-34a和miR-21前体序列pre-miR-138、pre-miR-34a和pre-miR-21插入上述改构的载体pCMV/p53-miR,将构建的pCMV/p53-miR-138、pCMV/p53-miR-34a和pCMV/p53-miR-21表达载体转染具有野生型p53的HeLa细胞和不表达p53的H1299细胞,分析p53对上述miRNA表达调控的影响。结果:转染改构的miRNA表达载体后,HeLa细胞中miR-138、miR-34a和miR-21的表达水平明显提高,它们对应的已知靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN的表达同时被显著下调。结论:在p53转录调控作用下,具有p53保守结合位点的miRNA表达载体能够更加有效地提高miRNA的表达水平;构建的载体不但可用于促进相关miRNA的表达,也能用于miRNA是否受p53调控的检测。

伊氏锥虫微管结合蛋白p15基因的分子克隆与表达

根据报道的布氏锥虫(Trypanosoma brucei)微管结合蛋白p15(Tb-MAPp15)基因及其3′非翻译区保守序列设计引物,采用PCR法从伊氏锥虫云南水牛株(Trypanosoma evansi stock YNB)基因组DNA中克隆得到伊氏锥虫微管结合蛋白p15(Te-MAP p15)基因。克隆片段长273bp,编码90个氨基酸,预测分子量9.0kDa。经同源性比较,所得基因与Tb-MAP p15基因同源率达到94%。抗原性分析Te-MAP p15基因表达的氨基酸序列比T.brucei微管结合蛋白p15多5个,均参与组成其中1个抗原决定簇,并且此抗原决定簇序列形成在蛋白中常作为识别位点的α螺旋。将该基因亚克隆到pGEX-6P-1原核表达载体,转化大肠杆菌E.coli RS21宿主菌,经IPTG诱导,可成功表达。重组融合蛋白大小为35kDa,与预期大小一致,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定为重组伊氏锥虫微管结合p15蛋白。

内毒素结合蛋白样分子p48体内外生物学活性的初步研究

目的以LBP为对照,对比研究p48的体内、外生物学功能。方法采用生物传感器、流式细胞分析技术研究p48与LPS及Lipid A的结合力。通过体外培养人单核细胞(U937)和小鼠体内TNF-α的分泌实验,研究p48的生物学功能。采用ELISA方法初步探索p48与LBP是否具有一定相似的空间结构。结果p48能促进LPS与PBMC结合,其活性为LBP的81%。p48能与LPS及Lipid A结合,其亲和常数(KD)分别为1.59×10-6、1.48×10-6mol/L。体内外实验中p48均能促进TNF-α的分泌,其生物学活性约为LBP的77%。高浓度抗NH-LBP Fab抗体能与p48特异性结合,p48部分空间结构与LBP可能有一定的相似性。结论p48具有与LBP相近似的生物学功能,在机体炎症反应中也发挥较重要的作用。

钙结合蛋白S100P在非肌层浸润性膀胱癌组织中的表达及临床意义

目的:探讨钙结合蛋白S100P在非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)组织中的表达及临床意义。方法:收集42例NMIBC患者的膀胱癌组织(NMIBC组)和16例膀胱囊肿患者的膀胱非癌组织(对照组),Western Blot检测两组组织中S100P的表达。将NMIBC患者分为S100P(+)组和S100P(-)组,比较两组患者临床特征、术后恢复情况及无复发生存率的差异。结果:NMIBC患者癌组织中S100P蛋白表达明显高于对照组(P<0.05)。S100P(+)组和S100P(-)组患者的肿瘤分期和肿瘤分级比较,差异有统计学意义(P<0.05);S100P(+)组患者术后并发症发生率和住院时间均明显高于S100P(-)组(P<0.05),3年无复发生存率明显低于S100P(-)组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:NMIBC患者存在S100P高表达,且其阳性表达可能与NMIBC的发生、发展及预后有关。

体外靶向TP53BP2基因shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

目的 本研究旨在构建靶向肿瘤蛋白p53结合蛋白2(TP53BP2)基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,以抑制肝癌细胞TP53BP2的表达。方法 设计了2对针对TP53BP2基因的RNA干扰序列,并合成相应的shRNA序列。shRNA退火形成双链oligo序列后,应用基因重组技术构建重组质粒,经菌落PCR和测序鉴定,将重组正确的质粒进行慢病毒包装和滴度测定,并采用Western Blot、qRT-PCR和激光共聚焦技术观察慢病毒Lenti-shTP53BP2对HepG2细胞TP53BP2基因的干扰效果。结果 测序比对结果显示,各重组慢病毒载体与设计参考序列一致,提示各重组慢病毒体构建成功;重组慢病毒载体经慢病毒包装后,显示pHS-ASR-LW429、pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513的滴度分别为9.7×108TU/mL、6.1×108TU/mL和6.4×108TU/mL;用慢病毒Lenti-shTP53BP2(pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513)感染HepG2细胞后,与对照慢病毒(pHS-ASR-LW429)比,经Western Blot、qRT-PCR和激光共聚焦结果显示两个Lenti-shTP53BP2均能显著下调HepG2细胞TP53BP2基因水平和蛋白表达量。结论 本研究成功构建了靶向TP53BP2基因shRNA慢病毒载体,其能有效下调HepG2细胞TP53BP2的表达,为进一步研究TP53BP2在肝癌发生发展过程中的机制研究奠定了基础。

p53反式结合hsp90β基因

目的探讨hsp90β基因中p53结合位点(+31/+60)是否参与p53与hsp90β基因的反式结合,以进一步揭示该位点在p53调节hsp90β基因转录中的作用。方法将含有p53结合位点的hsp90β基因片段插入质粒pBS-SK,然后将它与突变引物和选择引物一起依次退火和延伸,经过两轮细菌转化,酶切筛选出突变阳性质粒后进行序列分析。采用电泳迁移率变更测定(EMSA)检测突变后基因片段与转染p53表达质粒的Jurkat细胞核抽提物的结合。结果序列分析证实p53结合位点第2个半位点核心序列的两个碱基已发生突变,EMSA结果表明,突变后基因片段不能与p53结合。结论hsp90β基因中p53结合位点的核心序列在p53与hsp90β基因的反式结合中起关键作用。