猴源GII．17型诺如病毒基因组P结构域及其变体的原核表达、纯化和抗原性鉴定

目的 表达、纯化和鉴定猴源GII.17型诺如病毒（NoV）基因组P结构域及其变体蛋白.方法 基于本实验室获得的猴源GII.17型NoV基因组P结构域的核苷酸序列,按大肠杆菌密码子使用的偏好性优化P结构域的核苷酸序列,人工合成相应的基因.以此基因为模板,通过PCR方法扩增得到P结构域的变体基因.采用无缝连接的方法将P结构域基因及其变体克隆到原核表达载体,进行蛋白诱导表达和纯化.最后,通过免疫印迹法和ELISA法分析表达蛋白的抗原性.结果 测序结果表明,P结构域及其变体成功地克隆至原核表达载体.SDS-PAGE分析显示,P结构域在原核细胞的超声裂解上清和沉淀中都有表达,而其变体主要表达于上清.免疫印迹和ELISA结果显示,表达纯化得到的P结构域及其变体蛋白具有很好的抗原性.表达的蛋白免疫小鼠制备的相应抗体ELSIA效价可达到1∶32000.结论 成功地表达了猴源GII.17 NoV基因组P结构域及其变体蛋白,并且通过免疫小鼠得到了相应的抗体,为后期检测试剂盒的研发、病毒鉴定和病毒受体结合实验奠定了基础.

HeLa细胞中编码人组织型纤溶酶原激活物K2P结构域突变体cDNA的克隆及特性

组织型纤溶酶原激活物(t-PA)在人体纤溶系统中发挥着重要作用。基因重组t-PA已被用于急性心肌梗死等血栓性疾病的溶栓治疗。另外,t-PA还与肿瘤浸润和转移等多种过程有关,因此对t-PA进行功能结构研究具有重要应用价值和理论意义。本实验用RT-PCR方法从豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol myristate acetate,PMA)处理的HeLa细胞扩增并克隆获得了人t-PA K2P结构域的编码cDNA。序列分析显示该序列含有两个碱基突变,分别导致了成熟蛋白分子两个氨基酸践基序列的改变。第263位密码子突变(ACC→GCC)导致Thr^(263)→Ala^(263),另一突变(CTG→CCG)导致Leu^(485)→Pro^(485)。两个突变分别位于K2和P结构域的连接区和P区。将此含有突变的K2Pt-PA cDNA重组到原核表达载体,在大肠杆菌中获得了表达。纤维蛋白平板法检测显示重组K2Pt-PA复性后具有纤溶活性。以上结果表明HeLa S3细胞表达一种具有纤溶活性的t-PA突变体。

诺罗病毒VA207衣壳蛋白P结构域特异性识别Lewis型寡糖的结构基础

诺罗病毒(Norovirus)是引起人类传染性胃肠炎的主要非细菌性病原体,具有高传染性和高适应性,往往爆发在人群密集区,感染严重者可导致脱水死亡。

p53诱导死亡结构域蛋白在大鼠创伤性脑损伤中的表达变化

目的:探索创伤性脑损伤病理过程中p53诱导死亡结构域蛋白(PIDD)的表达变化。方法:建立大鼠脑损伤模型,采用免疫印迹法和免疫组织化学法检测损伤后的大鼠皮层组织中PIDD的表达和定位变化。结果:(1)在假手术脑组织中,PIDD表达很低,脑损伤后其表达逐渐增加,在3天左右达到最高峰,之后表达下降;(2)免疫组织化学法和免疫荧光实验表明,PIDD在损伤后的脑组织中表达明显上升,并且主要定位于神经元之中。

牛朊蛋白和酵母朊毒体结构域融合蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

利用DNA重组技术将酵母Ure2p朊蛋白结构域(UPD)基因插入牛朊蛋白(BPrP)表达质粒pET-PrP中,构建原核表达载体pET-PrP-UPD。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG诱导下获得高效表达。Westernblot检测表明表达的重组蛋白与单克隆抗体6H4呈现特异性反应,且纯化的PrP-UPD融合蛋白在体外具有聚集成淀粉样纤维、抵抗蛋白酶K消化等朊毒体的结构特点。利用纯化的PrP-UPD免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经克隆和筛选,获得3株稳定分泌抗重组PrP单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1G3、3A4、4D1,其中1G3分泌的单抗能识别细胞型牛朊蛋白,其Ig亚类为IgG2b,腹水ELISA效价为1×105,Western blot表明该单抗具有较强的特异性。

非小细胞肺癌组织EMSY、PIDD表达与同源重组修复基因的相关性及其临床意义

目的研究非小细胞肺癌(NSCLC)组织中EMSY转录抑制因子(EMSY)、p53诱导的死亡结构域蛋白1(PIDD)表达与同源重组修复基因表达的相关性及临床意义。方法选择2022年1月—2023年4月河北北方学院附属第一医院呼吸与危重症医学科诊治NSCLC患者80例。采用实时荧光定量PCR检测癌组织及癌旁组织中EMSY、PIDD表达与同源重组修复基因人乳腺癌易感基因1(BRCA1)、切除修复交叉互补基因1(ERCC1),核糖核苷酸还原酶亚单位1(RRM1)表达。Pearson相关分析EMSY、PIDD表达与同源重组修复基因表达的相关性;分析EMSY、PIDD表达与NSCLC临床病理相关参数的关系及在NSCLC诊断中的价值。结果NSCLC癌组织中EMSY、PIDD、BRCA1、ERCC1、RRM1 mRNA相对表达量均高于癌旁组织(t/P=30.176/<0.001,27.821/<0.001,25.075/<0.001,16.680/<0.001,25.610/<0.001)。NSCLC癌组织中EMSY、PIDD mRNA与BRCA1、ERCC1、RRM1 mRNA表达均呈正相关(r/P=0.654/<0.001,0.712/<0.001,0.584/<0.001;0.724/<0.001,0.661/<0.001,0.563/<0.001)。低分化程度、有淋巴结转移及TNM分期Ⅲ期NSCLC癌组织EMSY、PIDD mRNA表达分别显著高于高中分化程度、无淋巴结转移及TNM分期Ⅰ~Ⅱ期NSCLC癌组织(t/P=13.693/<0.001,13.380/<0.001,12.197/<0.001;10.289/<0.001,11.130/<0.001,9.405/<0.001)。EMSY、PIDD mRNA及两项联合诊断NSCLC的AUC分别为0.834、0.802、0.906,两项联合诊断的AUC大于单一指标(Z=4.751、5.257,P均<0.001)。结论EMSY、PIDD在NSCLC癌组织中表达升高,与同源重组修复基因表达及不良临床病理特征有关,两者联合有助于NSCLC的诊断。

p53活性四聚体全原子分子动力学分析

p53是一种肿瘤抑制蛋白,对阻碍癌症发展、维持遗传完整性起着至关重要的作用.在细胞核内,4个p53分子通过高度协同的方式、通过DNA结合域与DNA结合,形成稳定的四聚体活性结构,并转录激活或抑制其靶向基因.然而,大多数肿瘤细胞中存在大量p53的突变,其中绝大部分突变发生在p53的DNA结合域,而p53的DNA结合域又是p53形成四聚体活性结构、调控下游靶基因转录的重要区域.本文通过全原子分子动力学模拟,研究了野生型p53四聚体内分子间的相互作用机制.结果表明,位于DNA两侧的对称二聚体是一个稳定的二聚体,在与DNA结合前后都能维持稳定的结构.位于DNA同侧的两个单体依靠两个接触面提供的蛋白-蛋白相互作用和DNA的骨架作用使四聚体活性结构保持稳定,这些相互作用为四聚体的形成机制提供了重要支撑.该工作厘清了p53四聚体在动力学过程中的内部相互作用机制和关键残基,揭示了四聚化过程中各个相互作用界面的关键位点,对于理解p53的抑癌机制、探索有效治癌策略、发展治癌药物具有重要意义.

NLRP6诱导胶质瘤细胞生物活性及对TGF-β1/Smad蛋白的作用

目的探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)P6诱导胶质瘤细胞生物活性及对转化生长因子(TGF)-β1/Smad蛋白的作用。方法将胶质瘤细胞U251分为正常组(U251细胞)、NC组(U251细胞+NC-空转)和干预组(U251细胞+NLRP6-shRNA),四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测24、48和72 h U251细胞增殖,Transwell小室法、流式细胞法、Western印迹和聚合酶链反应(PCR)法分别检测24 h后U251细胞迁移数目、凋亡率、TGF-β1/Smad蛋白和mRNA表达。结果与正常组比较,NC组及干预组细胞侵袭数目、TGF-β1 mRNA及蛋白表达水平显著降低;细胞凋亡率、Smad4 mRNA及蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。与NC组比较,干预组细胞侵袭数目、TGF-β1 mRNA及蛋白表达水平显著降低;细胞凋亡率、Smad4 mRNA及蛋白水平显著升高(均P<0.05)。结论沉默NLRP6能够降低胶质瘤细胞U251细胞活性,其作用机制可能与抑制TGF-β1水平及激活Smad4水平相关。

丹参多酚酸介导PIDD通路改善大鼠缺血性脑损伤的机制研究

目的探讨注射用丹参多酚酸(SA)对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其与p53诱导的死亡结构域蛋白(PIDD)通路的关系。方法选择40只健康雄性SD大鼠,随机均分为4组:假手术组、缺血模型组、丹参多酚酸组、抑制剂组,每组10只。采用改良线栓法构建大鼠右侧大脑中动脉栓塞模型,改良的神经功能缺损评分(mNSS)法评估神经功能缺损程度,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法和Western blot法检测各组大鼠缺血再灌注后不同时间点(1 d、3 d、7 d)脑组织匀浆中PIDD mRNA及蛋白表达变化,以及7 d半胱氨酸天冬氨酸酶2(caspase-2)、t-BID、细胞色素C、半胱氨酸天冬氨酸酶3(caspase-3)蛋白表达。取缺血再灌注后7 d脑组织,采用TUNEL法检测神经细胞凋亡情况,计算梗死灶脑组织神经细胞凋亡指数(AI)。结果与缺血模型组比较,丹参多酚酸组在缺血再灌注后3 d、7 d时神经功能缺损评分明显降低(P<0.01);与抑制剂组比较,丹参多酚酸组缺血再灌注后3 d、7 d神经功能缺损评分高于抑制剂组(P<0.01)。丹参多酚酸组PIDD mRNA和蛋白的表达显著低于缺血模型组,高于抑制剂组(P<0.01);丹参多酚酸组caspase-2、t-BID、细胞色素-c和caspase-3蛋白的表达显著低于缺血模型组,高于抑制剂组(P<0.01)。缺血模型组AI[(53.25±4.16)%]显著增加,丹参多酚酸组AI[(35.13±4.23)%]和抑制剂组AI[(24.5±5.14)%]均低于缺血模型组(P<0.05)。结论丹参多酚酸通过下调PIDD及其下游半胱氨酸天冬氨酸酶2、t-BID、细胞色素-C和半胱氨酸天冬氨酸酶3的表达改善大鼠脑缺血损伤。

基于p75神经营养素受体提出PND治疗的新思路

围术期神经认知功能障碍(PND)被推荐用以定义围术期认知功能下降,包括术后谵妄(POD)和术后认知功能障碍(POCD)[1,2]。PND主要表现为对多个认知领域产生影响,如注意力、记忆、执行能力及信息处理速度等[3],主要特点是患者在麻醉和手术之后认知功能的长时间下降和衰退[4],严重降低了患者生活质量,延长术后住院时程,且具有较高的死亡率[5]。尽管PND受到越来越多的关注和重视,但其确切的病理机制尚不清楚。

CBP/P300溴结构域联芳基类抑制剂三维定量构效关系研究

CREB结合蛋白(CBP)和与其高度同源的P300蛋白是组蛋白乙酰化酶的两个亚型,两者通过它们的溴结构域(bromodomain,BRD)与染色质结合,目前,CBP/P300已经成为人类在肿瘤靶点领域中的研究热点。本研究基于CBP/P300溴结构域联芳基类抑制剂建立三维定量构效关系,采用比较分子力场分析法(Co MFA)和比较分子相似性指数分析法(Co MSIA)分别建立35个已知活性抑制剂的3D-QSAR模型,以确定CBP/P300溴结构域联芳基类抑制剂分子结构与生物活性之间的定量关系。Co MFA和Co MSIA模型活性数据p IC50的预测值与实验值基本一致,说明这两个模型具有较高的预测能力和统计学意义。根据Co MFA和Co MSIA模型所提供的立体场、静电场、疏水场、氢键给体场、氢键供体场等信息提出了改善此类抑制剂活性的药物设计思路,为指导设计具有更高活性的新分子和预测更加有效的CBP/P300溴结构域抑制剂提供理论依据。

模式识别受体在动脉粥样硬化中的作用及相互关系

细胞膜上Toll样受体和胞浆内核苷酸结合寡聚结构域样受体是两类主要的先天免疫模式识别受体,它们通过诱发非感染性炎症反应并相互协同参与动脉粥样硬化的发生和发展,是介导先天免疫反应与动脉粥样硬化发生的桥梁。

一种能实现蛋白可逆表达的敲入载体构建方法

在细胞或小鼠中使用Cre重组酶(Cyclization Recombination Enzyme,即环化重组酶)条件性地删除或修饰基因是不可逆的,基因删除后蛋白不能恢复表达。FK506-雷怕霉素结合蛋白FKBP L106P不稳定结构域(FKBP L106P destabilization domain)DD-C-Shield1系统可以解决这个问题,能人为控制蛋白表达或降解,避免胚胎致死。本实验以小GTP酶腺苷二磷酸核糖基化因子6(ADP-ribosylation factor 6,ARF6)为例,借助EL350细菌中Red/ET重组作用,使用DD-C-Shield1系统和重叠延伸PCR方法,发展一种通用的可实现蛋白可逆表达的构建敲入载体的方法。该方法缩短了构建时间,减少了重组的步骤,不需要使用rps L-neo DNA、链霉素和酶切位点。此敲入载体两侧同源臂5 kb左右,可用传统的ES打靶方法构建敲入小鼠,经过简单改造也可使用CRISPR/Cas9方法构建敲入细胞或小鼠模型,从而在细胞和动物模型中进行条件性修饰、快速、可逆地调节特异性蛋白表达,以利于发育学研究,为细胞和活体生物严谨调控蛋白功能提供了一种新的策略。