P-选择素与心肌缺血再灌注损伤及其单克隆抗体的应用研究

选择素(selectin)是一种细胞粘附分子,通过介导多形核白细胞与冠状血管内皮细胞之间粘附,对缺血心肌产生再灌注损伤。目前,应用其单克隆抗体的治疗正逐步显示出它的重要性,并将逐步从实验研究走向临床应用。

L-选择素单克隆抗体对缺血/再灌注损伤皮瓣的保护作用

目的:探讨L-选择素单克隆抗体在缺血/再灌注损伤皮瓣中的作用。方法:在大鼠缺血/再灌注损伤皮瓣模型,分别应用L-选择素单克隆抗体观察皮瓣成活面积及组织改变。结果:术后7天时皮瓣成活面积分别为:假性实验组为100%;生理盐水对照组为(18.3±19.6)%;实验组为(85.63±22.05)%。组织学观察发现:生理盐水对照组有大量的炎细胞浸润、组织肿胀、大部分皮肤组织坏死;L-选择素单克隆抗体使用实验组则炎症症状明显减轻、坏死组织减少,基本与假性实验组近似。结论:L-选择素单克隆抗体可以明显减轻缺血/再灌注损伤,从而提高缺血/再灌注损伤皮瓣成活面积。

乳牛L-选择素单克隆抗体的制备与亚类鉴定

以乳牛L-选择素为免疫抗原免疫BALB/c小鼠1只,相隔14 d进行3次免疫,抗原用量每次30μg,首次免疫后第116 d进行尾静脉加强免疫,抗原用量10μg。免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后接种12块96孔板。以L-选择素包被酶标板,间接ELISA检测阳性孔,有限稀释法克隆阳性孔,筛选出6株杂交瘤细胞。小鼠腹腔注射杂交瘤细胞株制备McAb,并对其分别进行Ig亚类测定。结果,6株杂交瘤细胞7B10、10F6、10E2、5C6、12G7和11A3的Ig亚类分别是IgG2a、IgG2aI、gG2bI、gG1I、gG1和IgG1。

携Sialyl Lewis^X与携抗P-选择素单抗靶向超声微泡粘附性的对比研究

目的对比评价携sialylLewis。与携抗P-选择素单抗靶向超声微泡粘附特性。方法采用“亲和素-生物素”桥接法构建携Sialyl Lewis、（MB-S）、携抗P-选择素单抗靶向超声微泡（MB-P）及携同型抗体微泡（MB-C）。MB-S、MB-P及MB-C以相同流速通过相应小鼠P-选择素Fc段包被培养皿时，利用平行板流动腔在不同时间点测定相应的MB-S、MB-P及MB-C（对照组）的结合数目、滚动数目以及解离时达到半数解离的剪切应力。结果MB-S结合数量前3min快速增加，其后随时间增加无明显变化，而MB-P结合数量与时间呈正相关（P〈0．05），且MB-S结合数目是MB-P的2～4倍；对照组MB-C未见明显结合（P〈0．05）。MB-S滚动数目大于MB-P（P〈0．05）；MB-S半数解离时剪切力小于MB-P（P〈0．05）。结论靶向超声微泡MB-S表现为早期、快速、不稳定的结合及滚动，MB-P表现为缓慢牢固结合。

通脉灵对糖尿病患者P-选择素、抗心磷脂抗体及C-反应蛋白的影响

目的观察糖尿病(DM)患者经通脉灵治疗后血浆CD62-p、ACA、CRP的变化,以评估其能否逆转DM患者血小板活化及微血栓前状态,阻断其病理过程的进展。方法CD62-p、ACA采用ELISA法;CRP采用免疫散射浊度法。所有患者停服抗凝剂一周后,空腹采静脉血分离血浆检测上述指标,随机分为A1组38例;A2组30例。分别采用通脉灵煎剂口服和川芎嗪静脉滴注治疗30d,疗程结束后重复检测以上指标并与安慰剂(B)组30例作对照。结果治疗后A1与A2组临床症状较B组明显改善,CD62-p、ACA、CRP均较治疗前下降(P<0.01、<0.05),尤其是CRP在第2疗程时A1组首先下降,但A2组下降不明显;疗程结束后血浆CD62-p、ACA水平A1较A2组降低显著,临床症状改善有不同程度的差别。结论通脉灵可显著改善DM患者血小板活化及微血栓前病理过程,可降低其心脑血管事件发生。

糖尿病联合检测P-选择素、C-反应蛋白和抗心磷脂抗体的意义

目的对糖尿病(DM)患者体内P-选择素(GD62-P)、C-反应蛋白(CRP)抗心磷脂抗体(ACA)水平进行联合检测,旨在探讨其对DM并发症早期评估和风险预测价值。方法60例DM患者被分成无并发症组(A组)和有并发症组(B组),C组为正常对照组。在未服用抗凝剂前或停服抗凝剂1周后,空腹采集血样立即离心血清-20℃保存待测。CRP采用免疫速率散射浊度法;GD62-P及ACA采用ELISA法。结果DM患者B组CRP高于C组,而A组与C组无显著差异;GD62-P在A、B组均升高,以B组升高显著(P<0.01);ACA在各组检出率表现不一,但仍以B组为高。三种检测指标的升高,大都集中在合并有心脑血管病变的患者中,上述指标的升高与DM血管病变发生率相一致。结论GD62-P、CRP、ACA联合检测对指导临床及早预防治疗糖尿病并发症,和对其并发症的风险评估有重要意义和实用价值。

抗P-选择素单抗的荧光素标记及其临床应用

目的 :探讨各种血栓形成相关性疾病患者的P -选择素的表达变化及其临床意义。方法 :用异硫氰酸荧光素 (FITC)标记抗P -选择素单抗SZ - 5 1-IgG和流式细胞术 (FCM)分析了 42例糖尿病患者、33例高血脂患者、2 3例脑梗塞患者和 2 0例正常人的血小板膜P -选择素表达 ,并与间接FCM和酶标记免疫吸附分析法(ELISA)作比较。结果 :FCM测得的血小板膜上P -选择素表达阳性率 ,在糖尿病组为 2 3 92 %± 15 83% ,高血脂组为 18 34 %± 9 46 % ,脑梗塞组为 19 32 %± 10 38% ,均显著高于正常对照 3 38%± 1 11% (P值均小于 0 0 1)。间接FCM测定血小板膜P -选择素表达在糖尿病和脑梗塞患者中均显著增高 ,ELISA法测得的血浆中P -选择素在糖尿病、高血脂和脑梗塞患者也显著高于正常对照。结论 :FITC标记的SZ - 5 1-IgG可用于FCM 。

抗P选择素免疫小鼠单链抗体噬菌体展示文库的构建和筛选

目的构建抗P-选择素的全套单链抗体噬菌体表面展示文库，从中 筛选与P-选择素高亲合力的单链抗体，为其临床应用奠定基础。方法从P-选择素免疫的小鼠脾淋 巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA后，用抗体可变区混合引物扩增全套轻、重链可变区基因，经重叠延伸反应，装配成单 链抗体（ScFv） 基因，将其克隆到噬菌体载体pHEN1中，构建单链抗体噬菌体抗体库。对抗体库进行亲合筛 选后, ELISA法鉴定抗活化血小板单链抗体。结果经过5轮“吸附-洗脱-扩增”的富 集过程，phage-ELISA得到一个ELISA活性较高的与P-选择素结合的克隆。序列测定符合抗体可变区结构特点。 结论成功构建了全套抗P-选择素单链抗体噬菌体展示文库，并筛选得到具有P-选择素结合能力的单链抗体基因 。

二位点酶联免疫测定血浆P-选择素方法的建立及临床意义

血小板活化与血管内皮细胞损伤在动脉血栓形成中起着重要的作用。P-选择素是血小板α-颗粒膜蛋白,它在血小板活化和释放过程中随着α-颗粒膜与血小板浆膜的融合暴露在血小板表面,成为体内血小板活化和血栓形成的特异标志。P-选择素有两种形式,其一是具有跨膜区域的整合型,另一种为缺乏跨膜区的游离型,后者在血小板活化时,释放到血浆内,成为血浆P-选择素的主要来源。因此,测定血浆内P-选择素的浓度变化,对体内血小板活化及血栓形成亦具有重要诊断价值。我们利用二株抗P-选择素的单克隆抗体,建立了双克隆抗体二位点酶联免疫测定血浆内P-选择素的方法,并测定了正常人和某些血栓性疾病病人血浆内P-选择素的浓度,为血栓性疾病的诊断提供了一个新的方法。

阿魏酸对H_2O_2诱导脐静脉内皮细胞表达P-选择素的影响

目的:探讨阿魏酸对H_2O_2刺激脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达P-selectin的影响。方法:应用培养的HUVECs经H_2O_2刺激,用FTTC标记抗P-选择素单抗SZ-51-1gG和FCM测定HUVECs表面表达的P-se-lectin,同时观察了阿魏酸对其表达的影响。结果:实验显示正常HUVECs表面表达少量的P-selectin,H_2O_2能刺激培养的HUVECs表面P-selectin表达增高,其中最适的H_2O_2刺激浓度在250-300μmol/L,最适的刺激时间为1.5-2 h;随着阿魏酸浓度增加,阿魏酸明显地抑制H_2O_2刺激HUVECs表面P-selectin的表达。结论:H_2O_2能刺激培养的HUVECs表面P-selectin表达增高,阿魏酸明显地抑制其表达。

过敏性紫癜患者血浆TM、vWF和P-选择素水平的研究

研究血浆凝血酶调节蛋白（thronmbomodulin TM）、血管假性血友病因子（von Willebrand factor vWF）和P-选择素在过敏性紫癜（ALP）发病机制中的作用。方法：采用ELISA法检测儿童过敏性紫癜患者血浆TM，vWF和P-选择素水平。结果：单纯型过敏性紫癜、合并肾脏损伤的过敏性紫癜患儿血浆TM，vWF和P-选择素水平均明显高于对照组（P〈0．05）；合并肾脏损伤的过敏性紫癜患儿血浆TM，vWF水平明显高于单纯型过敏性紫癜（P〈0．05）；单纯型过敏性紫癜患儿血浆P-选择素水平与合并肾脏损伤的过敏性紫癜患儿之间比较无统计学意义（P〉0．05）。

P-选择素单抗抗唾液腺腺样囊性癌细胞裸鼠肺粘附的研究

目的观察P-选择素单克隆抗体(MonoantibodytoP-selectin,PS1)对腺样囊性癌肺高转移细胞肺粘附的抑制作用。方法裸鼠尾静脉注射P-选择素单抗后,经尾静脉注射氚标胸腺嘧啶核苷(3HTdR)标记的ACC-M细胞,分别检测细胞注射后2h、6h、18h的单位重量肺、肝组织每分钟核素脉冲数(CPM)。结果空白对照组单位重量肺组织在2h、6h、18h的CPM值分别是1875.75±11.53、1644.50±27.20和1466.50±125.95;P-选择素单抗组肺组织2h、6h、18h的CPM值分别是941.50±68.47、875.00±47.06和787.25±65.38。相同时间P-选择素单抗组肺组织CPM值明显低于对照组,两组间有显著性差异(P<0.001)。空白对照组单位重量肝组织的CPM值与P-选择素单抗组相比,2h、6h、18h各相同时间两组间无显著性差异(P>0.05)。结论P-选择素单抗静脉应用后,可减少肺组织内ACC-M细胞的粘附数量,但对相同时间肝组织内ACC-M细胞数量无显著影响。

人P-选择素胞外区Lectin片段真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建人P 选择素 (P selectin)胞外区凝集素 (Lectin)片段的真核表达载体。方法 从人血小板中提取总RNA ,经RT PCR得到P 选择素cDNA基因 ,用PCR方法扩增其中的Lectin片段 ,并将其克隆到真核表达载体 pcDNA4/HisMaxA中 ,构建了PCMV 启动控制基因表达质粒 pcDNA4/HisMaxA P selectin’sLectin。结果 通过酶切和基因序列分析确定重组入载体 pcDNA4/HisMaxA的片段为目的基因的核苷酸序列。 结论 重组质粒 pcDNA4/HisMaxA P selectin’sLectin的成功构建 ,为在真核细胞中高效表达该表位片段对应蛋白并制备其抗体作进一步研究提供基础。

P-选择素与糖尿病血管病变

糖尿病并发血管病变与血小板活化及内皮受损、血管内皮功能减退密切相关。近年研究证实,P-选择素通过促进白细胞与血小板和内皮细胞的粘附造成内皮损伤和血管内微血栓形成,在糖尿病大血管病变、糖尿病微血管病变的发生发展中具有重要作用。P-选择素及其单克隆抗体的研究将为临床诊治糖尿病血管病变提供新的思路。

选择素单抗对裸鼠胃癌转移抑制的研究

晚近发现的粘附分子P-选择素.能介导血小板和内皮细胞与肿瘤细胞之间相互作用,在肿瘤转移过程中起粘附介导作用。该文用人胃癌细胞株原位移植方法建立动物模型.术后分别注射P-选择素单克隆抗体或PBS液体。结果发现.PBS对照组肿瘤转移率为54.5%。单抗组仅1例有肿瘤转移。ELISA法测定显示,肿瘤转移裸鼠血浆P-选择素含量显著高于非转移裸鼠。表明P-选择素与肿瘤转移相关,其单抗对肿瘤转移有抑制作用。

P选择素和ICAM-1对小鼠溃疡性结肠炎的研究

目的:探讨P选择素单克隆抗体(单抗)对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用及其治疗机制。 方法:在小鼠溃疡性结肠炎模型上观察了黏附分子P选择素和TCAM-1的变化,并用P选择素单抗对其进行阻断治疗。 结果:溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜充血、水肿,糜烂或溃疡(以直肠和远端结肠明显),上皮细胞坏死、脱落,黏膜炎症细胞浸润(主要为中性粒细胞)及隐窝脓肿形成;P选择素单抗处理鼠未见明显病理变化,疾病活动指数(DAI)和病理学评分明显改善。ELISA法测定发现,溃疡性结肠炎时血浆P选择素和血清ICAM-1水平显著升高,而经P选择素单抗处理的小鼠P选择素未见升高。 结论:P选择素和ICAM-1与溃疡性结肠炎密切相关,P选择素举抗对溃疡性结肠炎具有治疗作用。

拮抗选择素对缺血/再灌注损伤皮瓣的保护作用

目的探讨E-、P-选择素单克隆抗体在缺血/再灌注损伤皮瓣中的作用。方法将36只健康的Sprague-Dawley雄性大鼠平均分成三组,在其腹部制作缺血/再灌注损伤皮瓣模型后,分别应用生理盐水,E-、P-选择素单克隆抗体,观察皮瓣成活面积及组织改变。结果应用后7d皮瓣成活面积:生理盐水对照组为(18.3±19.60)%;E-选择素单克隆抗体组为(54.38±40.49)%;P-选择素单克隆抗体组为(83.75±17.87)%。组织学观察:生理盐水对照组有大量的炎细胞浸润、组织肿胀、部分皮肤组织坏死;E-、P-选择素单克隆抗体组炎症反应明显轻,坏死组织少,而P-选择素单克隆抗体组的效果尤为明显。结论E-、P-选择素单克隆抗体可以减轻缺血/再灌注皮瓣的损伤,从而提高缺血/再灌注损伤皮瓣的成活面积。

P选择素单抗对肝缺血再灌注时细胞凋亡的影响

目的探讨P选择素及其单克隆抗体对肝缺血再灌注损伤及细胞凋亡的影响。 方法建立大鼠肝缺血再灌注损伤模型 ,分别采用免疫组化LSAB法和原位DNA片段末端标记法检测有或无P选择素单抗治疗组肝组织中P选择素表达及凋亡细胞。 结果大鼠肝缺血再灌注时 ,肝组织出现显著病理改变及细胞凋亡 ,且P选择素在肝组织中表达 ;P选择素单抗作用组肝组织无明显病理变化且细胞凋亡减少 ,肝组织中未见P选择素表达。 结论P选择素介导中性粒细胞浸润和细胞凋亡 。