大鼠肺动脉平滑肌细胞Rho激酶对p-Smad1核迁移的作用及机制

目的:研究Rho激酶对p-Smad1核迁移的作用及信号转导途径,探讨它们在肺血管重构中的作用机制。方法:分离培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞,应用血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)启动肺动脉平滑肌细胞Rho激酶信号通路,应用骨形态发生蛋白2(BMP-2)启动BMP信号通路,并用Rho激酶抑制剂Y-27632、MEK抑制剂U0126进行干预。培养细胞分成5组:(1)对照组;(2)BMP-2组;(3)BMP-2+PDGF-BB组;(4)BMP-2+PDGF-BB+Y-27632组;(5)BMP-2+PDGF-BB+U0126组。免疫荧光染色标记p-Smad1在细胞核内外的分布并计算p-Smad1核迁移阳性细胞百分数(即核迁移率)。分离平滑肌细胞核蛋白和胞浆蛋白,West-ern blotting分析p-Smad1在细胞内的总量和细胞核内外相对含量的变化。Kit-WST-8试剂盒检测细胞增殖。结果:BMP-2组p-Smad1在细胞内的总量、在细胞核中的相对含量和核迁移率明显高于对照组(P<0.05);BMP-2+PDGF-BB组p-Smad1的核迁移率和在细胞核中的相对含量明显低于BMP-2组(P<0.05),但是细胞内p-Smad1总量无明显改变(P>0.05);BMP-2+PDGF-BB+Y-27632组和BMP-2+PDGF-BB+U0126组细胞内p-Smad1的总量、在细胞核中的相对含量和核迁移率与BMP-2组基本相似(P>0.05)。BMP-2组的A值明显小于对照组(P<0.05);PDGF-BB+BMP-2组的A值明显大于BMP-2组(P<0.05)且大于对照组(P<0.05);BMP-2+PDGF-BB+Y-27632组和BMP-2+PDGF-BB+U0126组的A值均小于PDGF-BB+BMP-2组(P<0.05)。结论:在大鼠肺动脉平滑肌细胞,PDGF-BB激活的Rho激酶通过MEK/ERK1/2抑制BMP-2引起的p-Smad1核迁移,促进平滑肌细胞增殖。

KA癫痫大鼠ALK5对TGF-β1-ALK1-p-Smad1通路的影响

目的研究癫痫大鼠ALK5对ALK1受体的作用,探讨可能的干预癫痫发作的新靶点。方法红藻氨酸(kainic acid,KA)侧脑室注入SD大鼠制备癫痫模型,随机分为KA模型对照组(A组)、ALK5抑制剂(SB431542)腹腔注射3 d组(B组)、ALK5抑制剂腹腔注射7 d组(C组),另设假手术组为空白对照组(NC组),每组各10只。NC组、A组、B组分别于3 d,C组于7 d取海马,检测海马组织中ALK1和其下游分子p-Smad1的mRNA及其蛋白的表达。结果与正常对照组相比,KA模型对照组大鼠海马区ALK1和p-Smad1的mRNA及蛋白表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05);与KA模型组相对比,ALK5抑制剂腹腔注射组(B组和C组)ALK1和pSmad1的mRNA及蛋白表达均下降(P<0.05)。结论 ALK5抑制剂腹腔注射后导致KA诱导的SD癫痫大鼠ALK1受体和p-Smad1表达下调。

皮肤纤维瘤中Smad1/2/3、p-Smad2/3和Smad4蛋白质表达的检测

目的:探讨转化生长因子β(TGF-β)信号转导途径中Smad1、Smad2、Smad3(Smad1/2/3),磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)和Smad4蛋白在皮肤纤维瘤中的表达特点及其意义。方法:采用EliVisionTMplus免疫组化技术检测皮肤纤维瘤与正常对照皮肤中Smad1/2/3、p-Smad2/3和Smad4的表达情况。结果:与正常皮肤相比,Smad1/2/3、p-Smad2/3和Smad4蛋白在皮肤纤维瘤的增殖表皮中表达下调,但在真皮内瘤体中大量增殖的梭形细胞中表达却显著上调。结论:皮肤纤维瘤瘤体中梭形细胞Smad1/2/3、p-Smad2/3和Smad4蛋白表达上调可促进TGF-β信号转导,有助于皮肤纤维瘤中纤维增殖状态的形成。

参葵通脉颗粒对慢性心衰心肌重塑及TGF-β1、p-Smad3表达影响的实验研究

目的:探讨参葵通脉颗粒治疗慢性心衰(CHF)的可能作用机制。方法:SD大鼠采用腹主动脉缩窄法制备慢性心衰模型,造模成功的大鼠随机分为模型组、阳性药(盐酸贝那普利)组和参葵通脉颗粒低、中、高剂量组,另以10只仅游离腹主动脉不缩窄的大鼠为假手术组。各组大鼠灌胃给予相应药物,模型组和假手术组灌胃等容积蒸馏水,每日1次,各组均干预4周。干预结束后采用生理多导仪检测各组大鼠血流动力学指标;分离大鼠左心室,称重,计算左心室指数(LVMI);马松(Masson)染色检测心肌纤维化情况;免疫印迹(western blot)检测各组大鼠心肌转化生长因子-β1(TGF-β1)、p-Smad3蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠左心室舒张期末压(LVEDP)显著升高,左心室内压最大上升及下降速率(±dp/dt max)显著降低(P<0.05);与模型组比较,参葵通脉颗粒各剂量组LVEDP显著降低,+dp/dt max、-dp/dt max显著升高(P<0.05);参葵通脉颗粒高剂量对上述指标的改善明显优于阳性药物(P<0.05)。假手术组大鼠心肌细胞排列整齐,形态正常;模型组大鼠心肌纤维排列紊乱,大量条状、束状胶原纤维增生;各给药组大鼠心肌细胞轻度肥大,肌细胞排列较整齐,有少量胶原纤维增生。模型组LVMI和胶原容积指数明显高于假手术组;各给药组上述指标均较模型组显著降低(P<0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织TGF-β1、p-Smad3蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,参葵通脉颗粒各剂量组TGF-β1、p-Smad3蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论:参葵通脉颗粒对CHF心肌重塑具有良好的改善作用,且可以减少心肌组织TGF-β1、p-Smad3蛋白的表达,这可能是其治疗CHF的机制之一。

BMP-4通过Smad1信号通路诱导头颈鳞癌细胞发生上皮-间质转化而调控其发生侵袭的研究

目的:体外试验探讨BMP-4及Smad1介导的信号通路在促进头颈鳞癌侵袭中的作用。方法:采用人重组BMP-4干预头颈鳞癌细胞(SCCHN)株,激光共聚集显微镜观察SCCHN细胞发生上皮-间质转化(EMT)的形态学改变。采用免疫印迹法检测蛋白的表达;侵袭试验用以检测细胞的侵袭力与迁移力的改变。结果:BMP-4可促进SCCHN细胞发生EMT形态学改变,同时促进细胞发生侵袭,EMT相关蛋白E-caherin显著下调,vimentin显著上调;Smad1磷酸化水平增高。结论:BMP-4可通过诱导头颈鳞癌细胞发生EMT从而促进肿瘤的转移,为头颈鳞癌转移机制研究开辟新的通路。

LDN-193189对人去分化软骨肉瘤细胞系NDCS-1的抑制作用研究

目的:检测骨形成蛋白(BMP)受体抑制剂LDN-193189对人去分化软骨肉瘤(DDCS)细胞系NDCS-1的抑制作用,探讨LDN-193189对去分化软骨肉瘤的抑癌机制。方法:以5 nmol/L的LDN-193189作用于NDCS-1细胞,MTT、平板克隆法检测LDN-193189对NDCS-1细胞的增殖抑制作用,Transwell法、划痕实验检测LDN-193189对NDCS-1细胞的侵袭抑制作用,Western blot检测BMPR2、p-Smad1/5及RUNX2的蛋白表达抑制情况。结果:药物处理后NDCS-1细胞增殖、侵袭被明显抑制;药物处理后NDCS-1细胞的BMPR2、p-Smad1/5及RUNX2蛋白表达下降。结论:LDN-193189通过抑制BMPR2-p-Smad1/5-RUNX2信号传导通路能有效抑制去分化软骨肉瘤细胞系NDCS-1的增殖侵袭能力。

ALK-3、Pax-8基因抑制后大鼠心肌细胞中Smad1/5/8的表达

目的:抑制大鼠胚胎心肌细胞株中ALK-3、Pax-8基因的表达后,探索Smad1/5/8在其中所起的作用。方法:将H9C2(2-1)大鼠胚胎心肌细胞分为4组:针对Pax-8基因的小干扰RNA(Pax-8 siRNA)组、ALK-3基因的小干扰RNA(ALK-3 siRNA)组、阴性对照(NC siRNA)组和空白对照组。前3组分别给予相应siRNA(5.0μL)和Lipofectamine 2000(5.0μL)配制成的siRNA-脂质体复合物溶液,空白对照组给予等量的细胞培养基。采用qRT-PCR测定Pax-8和ALK-3的mRNA表达,Western blot法检测磷酸化Smad1/5/8(p-Smad1/5/8)和半胱天冬酶(Caspase)-3表达。结果:与NC siRNA组和空白对照组比较,Pax-8 siRNA组的Pax-8 mRNA表达分别下调50%(P<0.05)和54%(P<0.05),ALK-3 siRNA组的ALK-3 mRNA表达分别下调49%(P<0.05)和53%(P<0.05),而NC siRNA组与空白对照组间差异无统计意义(P>0.05)。与NC siRNA组和空白对照组比较,ALK-3 siRNA组p-Smad1/5/8的蛋白表达量分别下调58%(P<0.05)和55%(P<0.05),Pax-8 siRNA组p-Smad1/5/8的蛋白表达量差异无统计意义(P>0.05)。NC siRNA组与空白对照组间差异无统计意义(P>0.05)。与NC siRNA组和空白对照组比较,Pax-8 siRNA组Caspase-3蛋白表达量分别上调76%(P<0.05)和81%(P<0.05),ALK-3 siRNA组Caspase-3的蛋白表达量分别上调135%(P<0.05)和140%(P<0.05),而NC siRNA组与空白对照组间差异无统计意义(P>0.05)。结论:在大鼠胚胎心肌细胞株中对基因ALK-3、Pax-8干扰后能引起细胞凋亡蛋白Caspase-3明显增多,并且在ALK-3 siRNA组发现Smad1/5/8蛋白磷酸化减少,而Pax-8 siRNA组中未发现Smad1/5/8磷酸化减少,提示Smad1/5/8在基因ALK-3被干扰后引起细胞凋亡蛋白Caspase-3增多中起重要作用。

BMP4蛋白在食管癌组织中的表达及对其预后的影响

目的:探讨BMP4蛋白在食管癌组织中的表达及对其预后的影响,为临床食管癌治疗提供新的思路。方法:采用免疫组化方法检测50例食管癌组织及其相对应的周边非癌组织新鲜标本中BMP4、Smad1及p-Smad1蛋白的表达,采用Spearman相关分析法分析BMP4蛋白与Smad1和p-Smad1蛋白在食管癌组织中表达的相关性,应用Log-rank检验分析上述三种蛋白表达量与食管癌患者预后的关系。结果:食管癌组织BMP4、Smad1及p-Smad1蛋白的表达量显著高于非癌食管组织(P<0.01)。食管癌组织中BMP4与Samd1蛋白表达量无明显相关关系(P>0.05),而与p-Samd1蛋白表达量呈正相关(r=0.491,P<0.01)。BMP4及p-Samd1的高表达是食管癌患者预后不良的因素(P<0.05),而Smad1的表达量与食管癌预后无明显关系(P>0.05)。结论:BMP4、Smad1及p-Smad1蛋白的高表达都可提示食管癌的发生,BMP4及p-Samd1蛋白的高表达可作为食管癌预后的预测指标。

脂溢性角化病、基底细胞癌和鳞状细胞癌中几种Smad蛋白质表达的检测

目的:探讨转化生长因子(TGF)-β信号转导途径中Smad1、Smad2、Smad3(Smad1/2/3),磷酸化Smad2,磷酸化Smad3(p-Smad2/3)和Smad4蛋白在脂溢性角化病、基底细胞癌和鳞状细胞癌中的表达特点及其意义。方法:采用EliVisionTMplus免疫组化技术分别检测脂溢性角化病、基底细胞癌、鳞状细胞癌以及正常对照皮肤中Smad1/2/3、p-Smad2/3、和Smad4的表达情况。结果:Smad1/2/3、p-Smad2/3和Smad4蛋白在脂溢性角化病、基底细胞癌和鳞状细胞癌中的表达较正常表皮显著降低。结论:脂溢性角化病、鳞状细胞癌和基底细胞癌中Smad1/2/3、p-Smad2/3和Smad4蛋白表达降低可能通过阻断TGF-β信号转导,有助于上述表皮肿瘤的形成和发展。

表达持续活化型ALK3抑制大鼠肝星状细胞活化

背景肝纤维化与肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)上皮细胞间充质转化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)相关, TGF-β1在其中起着重要的作用,而BMP7能够拮抗TGF-β1,目前主要研究的是TGF-β/BMPs-Smad信号通路, ALK3属于BMPs的持续活化Ⅰ型受体,在肝纤维化分子研究机制中较少运用.目的观察大鼠HSCs中稳定表达持续活化型ALK3时Sma d1磷酸化及纤维化相关基因E-cadherin、α-SMA、col1A2等表达情况,探讨BMP-7信号转导在肝纤维化发生发展过程中拮抗TGF-β1信号及其抗肝纤维化机制.方法建立体外培养大鼠HSCs (HSC-T6)持续活化型ALK3的稳定表达细胞株, MTT检测细胞的增殖;RT-PCR检测col1A2等相关分子mRNA水平;Western blotting检测Samd1、E-cadherin、α-SMA、col1A2蛋白表达和Smad1磷酸化;显微镜下观察细胞形态.结果稳定表达持续活化型ALK3的HSC-T6细胞增殖受到抑制, Smad1磷酸化显著升高,α-SMA, col1A2表达下调, E-cadherin表达上调.结论BMP-7信号转导通过增强Samd1的磷酸化而拮抗TGF-β1致纤维化作用,抑制大鼠HSCs的活化.

复方精油对PM_(2.5)诱导小鼠肺微血管内皮细胞内皮间质转化的影响

探讨复方精油对PM_(2.5)诱导小鼠肺微血管内皮细胞(MHC)内皮间质转化(EndMT)的干预作用,并从TGF-β1/SMAD3/p-SMAD3通路分析其可能的调节机制。建立PM_(2.5)诱导小鼠MHC和复方精油干预模型,测定细胞活力和迁移能力的变化;采用RT-qPCR和Western blot检测CDH5、CD31、Col1、Acta2、S100A4和TGF-β信号通路相关因子的水平变化。结果表明复方精油可减弱PM_(2.5)对细胞迁移能力的影响;EndMT相关因子的表达随PM_(2.5)作用时间的延长呈现正向发展趋势,复方精油对PM_(2.5)诱导产生的EndMT有良好的干预作用;TGF-β1、TGF-βR1和p-SMAD3的表达均呈现下降趋势,EndMT相关因子的表达水平也有所逆转。复方精油可缓解PM_(2.5)诱导的EndMT进程,其作用与TGF-β1/SMAD3/p-SMAD3信号通路相关。

芪苈强心可减弱房颤家兔心房结构重构

本研究旨在考察芪苈强心对房颤家兔心房结构重构的影响。将30只家兔随机分成假手术组、模型组和芪苈强心组,每组10只。建立心房颤动家兔模型前1周及建模后4周,每天按2.5 g/kg的剂量对芪苈强心组家兔灌胃芪苈强心。实验结束时检测三组家兔的超声心动图指标,然后应用组织学、免疫组化和蛋白质印迹分析检测心房组织中的DHPR、TGF-β1、P-smad 2/3、collagenⅢ和MMP9蛋白表达。研究显示,芪苈强心组家兔的LVEDD和IVSd显著低于模型组(p<0.05),而LVEF显著高于模型组(p<0.05)。芪苈强心组的纤维化面积和心肌细胞凋亡比例显著低于模型组。芪苈强心处理可显著增加DHPR的蛋白水平。芪苈强心处理显著降低了TGF-β1和P-smad 2/3蛋白表达的水平。芪苈强心处理可显著下调collagenⅢ和MMP9蛋白的水平。本研究表明,芪苈强心可通过抑制TGF-β1/P-smad 2/3信号通路及其下游纤维化分子来减轻心房颤动家兔模型的心房组织纤维化并抑制心肌细胞凋亡,从而减弱心房结构重塑和电重构。

产前他克莫司治疗对先天性膈疝大鼠病理模型肺血管重构的影响

目的 探讨产前对合并肺发育不良及肺动脉高压(PAH)的先天性膈疝(CDH)大鼠病理模型,采取他克莫司(FK506)治疗的抗血管重构作用及其作用机制。方法 选取17只健康、成年的无特定病原体(SPF)级Sprague Dawley(SD)大鼠为研究对象,均为8周龄,雌、雄鼠分别为12、5只。采用除草醚构建CDH大鼠病理模型。12只雌鼠受孕后,通过随机数字表法,根据不同处理方式处理分为FK506组(n=3)、CDH组(n=3)、CDH+FK506组(n=3)和对照组(n=3)。观察4组胎鼠肺组织发育情况,采取血管弹性纤维染色(EVG),观察肺血管厚度;α-SMA和CD31免疫荧光双重染色,检测胎鼠新生血管生成;Western blotting法检测胎鼠肺组织中BMPR2、p-SAMD1、p-SMAD5蛋白的表达水平。本动物实验均经电子科技大学附属医院·四川省人民医院动物实验伦理委员会伦理审查通过[伦审(研)2022年第191号]。结果 (1)4组胎鼠的双肺重量和双肺重量/胎鼠体重总体比较,差异均有统计学意义(H=81.25、106.98,P均<0.001),而4组胎鼠体重总体比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)EVG染色结果显示,4组胎鼠肺动脉中膜厚度百分比(MT%)和肺泡面积百分比(S%)总体比较,差异均有统计学意义(F=13.26、P=0.006,F=37.48、P<0.001)。其中,CDH组胎鼠MT%,较对照组增厚(P=0.001);CDH+FK506组大鼠肺动脉MT%,则较CDH组降低(P=0.002)。(3)4组CDH胎鼠α-SMA和CD31阳性细胞增殖指数分别总体比较,差异均有统计学意义(F=33.76、9.18,P<0.05)。进一步进行4组间两两多重比较的结果显示,CDH组分别和CDH+FK506组、对照组组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)FK506组、CDH+FK506组和对照组3组胎鼠BMPR2、p-SMAD1蛋白相对表达水平总体比较,差异均有统计学意义(F=11.45、10.94,P<0.05),而3组胎鼠p-SMAD5蛋白相对表达水平总体比较,差异无统计学意义(F=0.01、P>0.05)。其中,CDH组胎鼠BMPR2、p-SMAD1表达水平,较对照组降低(P=0.049、0.018),CDH+FK506组BMPR2、p-SMAD1表达水平,则较CDH组升高(P=0.010、0.023)。结论 在除草醚诱导的CDH大鼠病理模型中,产前对其采取FK506干预,可以减轻CDH大鼠模型的肺血管重构,对缓解CDH大鼠的肺发育不良具有正面影响。

姜黄素对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及可能机制

目的探讨姜黄素对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及可能机制。方法 36只SD大鼠随机分为对照组(control组)、糖尿病肾病模型组(DN组)和姜黄素治疗组(Cur组),每组12只。于造模成功后第8周,生化分析仪检测各组大鼠血清肌酐(Scr)与尿素氮(BUN)的含量;称量各组大鼠体重和肾重,测定肾指数;ELISA方法检测各组大鼠肾组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)与谷胱甘肽(GSH)的表达水平;Masson染色观察肾组织纤维化的形态学变化;Western blot方法检测各组大鼠肾组织TGF-β1、p-Smad2以及Collagen I的表达变化。结果姜黄素能够降低糖尿病肾病大鼠血清中Scr、BUN含量、降低肾脏指数(P<0.05);升高SOD活性与GSH水平,降低MDA含量(P<0.05);减轻肾小球系膜基质增生程度、减少胶原纤维沉积(P<0.05);下调糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β1、p-Smad2与Collagen I的表达(P<0.05)。结论姜黄素可能通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路减轻糖尿病肾病大鼠的氧化应激和肾纤维化。