家蚕脂肪酶基因Bmlipase-1在不同BmNPV抗性水平家蚕品种间的表达差异

家蚕脂肪酶Bmlipase-1在家蚕中肠组织特异性表达,具有抵抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染的活性。以对BmNPV具有不同抗性水平的6个家蚕品种为材料,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测Bmlipase-1基因在不同家蚕品种5龄期健康幼虫中肠组织的表达水平及感染BmNPV后的5龄期幼虫中肠组织中该基因的表达水平变化,探究该基因表达水平与家蚕对BmNPV的抗性水平的关系。结果表明:不同家蚕品种间Bmlipase-1的表达水平差异显著,抗性较强的品种,其表达水平较高,6个供试品种5龄幼虫中肠组织中的Bmlipase-1表达水平依次为NIL.LVR>P50>CVDAR18>nsd.NIL>892>306,抗性较强品种NIL.LVR 5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306的8.2倍;BmNPV能够诱导Bmlipase-1的表达,但不同品种间该基因的诱导表达差异显著,仍表现为抗性较强的品种该基因的诱导表达水平较高,NIL.LVR经BmNPV感染诱导后Bmlipase-1在5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306平均诱导表达水平的12.4倍。推测Bmlipase-1的表达水平与蚕体自身对BmNPV的抗性水平有一定的关联性。

鹅源新城疫病毒NP、P和L基因的克隆与P基因的表达鉴定

将鹅源新城疫病毒的NP、P和L基因通过RT PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pGEM Teasy载体 ,再分别亚克隆到真核表达载体pCI neo上 ,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确。利用P基因开放性阅读框 (ORF)上靠近终止密码上游的AgeI位点 ,将报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)基因克隆进P基因真核表达重组质粒 ,分别转染COS 1细胞和CEF细胞 ,在倒置荧光显微镜下可见到绿色荧光 ,表明GFP基因已得到表达 ,由此证明P基因也已得到表达。鹅源新城疫病毒NP、P和L基因的克隆成功 。

pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP真核表达质粒构建

目的:构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP与pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP真核表达质粒,并观察pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒在MCF-7和Bcap-37细胞中的表达。方法:①采用RT-PCR技术扩增CYP19 cDNA,插入pcDNA3.1(+)载体中,构建pcDNA3.1(+)-CYP19表达质粒;酶切pcDNA3.1(+)-CYP19(304bp BamHⅠ)-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19质粒,构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP表达质粒;②以pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒为模板,采用定点突变技术,构建pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP及pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP表达质粒;③pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒通过脂质体介导转染MCF-7和Bcap-37细胞,荧光显微镜观察其在细胞中的表达。结果:①酶切鉴定及测序验证pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP构建成功;②测序验证pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP及pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP构建成功;③在经转染的MCF-7和Bcap-37细胞中观察到较强的绿色荧光。结论:pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP及pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP真核表达质粒已成功构建,并证实pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒能在MCF-7和Bcap-37细胞中表达,为进一步研究CYP19基因单核苷酸多态性的确切功能奠定基础。

理脾调脂胶囊对血脂失调症大鼠及ApoE基因敲除小鼠PPARs mRNA的调控作用

目的研究理脾调脂胶囊对血脂失调症大鼠及ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠PPARα、γmRNA的调控作用,探讨其调节脂质代谢的作用机制。方法 48只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、理脾调脂胶囊治疗组(理脾调脂组)、血脂康对照组(血脂康组),造模4周,将ApoE-/-小鼠30只随机分为空白组、血脂康组、理脾调脂组。理脾调脂组大鼠、ApoE-/-小鼠(以下简称大、小鼠)每日灌胃理脾调脂胶囊,血脂康组每日灌胃血脂康,用药8周。酶法测定大、小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)浓度,沉淀法测定大、小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C);内参照模板法荧光定量PCR检测大、小鼠肝脏PPARα、γmRNA的表达。结果理脾调脂组大、小鼠血清TC、TG、LDL-C浓度较模型组、空白组显著降低(P<0.01),HDL-C浓度显著提高(P<0.01),大、小鼠PPARα、γmRNA表达较模型组(或空白组)显著提高(P<0.01);与血脂康组比较,理脾调脂组大、小鼠血清TC、TG、LDL-C浓度均降低(P<0.05),HDL-C浓度均显著提高(P<0.01,P<0.05),PPARα、γmRNA表达明显提高(P<0.05)。结论理脾调脂胶囊能显著提高实验性血脂失调症大、小鼠肝脏PPARα、γmRNA的表达,具有调控核因子而影响血脂代谢的作用。

ApNPV诱导柞蚕脂肪体和中肠组织中3个脂肪酶基因的表达及表达载体构建

根据柞蚕cDNA文库数据设计特异引物,以柞蚕蛹脂肪体cDNA为模板克隆了3个脂肪酶基因,命名为lipase1462（GenBank登录号：KJ638233）、lipase1501（GenBank登录号：KJ638234）和lipase1725（GenBank登录号：KJ638235）。3个基因编码的蛋白质具有昆虫脂肪酶家族的保守结构域及活性位点,与家蚕脂肪酶Bmlipase-1有较近的亲缘关系。为探究柞蚕脂肪酶基因的表达调控是否与柞蚕抵抗柞蚕核型多角体病毒（ApNPV）的侵染有关联,利用实时荧光定量PCR技术检测柞蚕幼虫在感染ApNPV后脂肪体和中肠组织中3个脂肪酶基因的表达水平。结果表明,柞蚕幼虫被ApNPV感染后48~60 h,脂肪体和中肠组织中3个脂肪酶基因的表达水平均明显上调,初步推测柞蚕脂肪酶可能与柞蚕对ApNPV侵染的免疫应答有关。分别构建柞蚕脂肪酶基因的原核和真核表达载体,SDS-PAGE检测显示柞蚕脂肪酶基因在原核和真核表达系统中均成功表达,为进一步研究柞蚕脂肪酶的生物学功能奠定了基础。

催青温度对家蚕二化性品种滞育激素受体基因表达的影响及基因的结构特征

家蚕二化性品种的卵滞育与否受上代环境影响,25℃高温明催青将产滞育卵,而15℃低温暗催青将产非滞育卵。为探究催青温度调控二化性家蚕滞育的分子机制,对从家蚕卵巢细胞中克隆的家蚕滞育激素受体基因(Bmdhr)的5种cDNA进行生物信息学分析,结果表明Bmdhr基因的5种cDNA由相同的mRNA转录本通过不同的剪接方式而来,其中Bmdhr mR-NA-1与Bmdhr mRNA-2编码的氨基酸序列相同,Bmdhr mRNA-4编码的氨基酸序列与家蚕滞育激素BmDHR-1的序列相似度达99.2%。将家蚕二化性品种秋丰的蚕卵用蛾区半分法分成2组,分别以15℃暗催青和25℃明催青,利用实时荧光定量PCR分析催青温度对家蚕不同发育时期及蚕体组织中Bmdhr基因mRNA转录的影响。结果显示:Bmdhr mRNA-1主要在蛹期卵巢中表达,在对滞育激素最敏感的化蛹后4 d时,其转录水平急速上升至峰值,并且高温催青的转录水平高于低温催青;Bm-dhr mRNA-4主要在各发育时期的蚕体血液中表达,特别是在高温明催青条件下,其在蛹期血液中的转录水平是低温暗催青的7.7倍,说明BmDHR-4可能是决定家蚕二化性品种卵滞育与否的关键因子之一;Bmdhr mRNA-5在化蛹后2～3 d的卵巢中转录水平高,且低温催青的转录水平高于高温催青,化蛹后3 d其转录水平开始下降,至化蛹后4～5 d 2种催青处理间的转录水平无显著差异。研究结果为阐明家蚕滞育的分子机制积累了实验数据。

洋葱假单胞菌G63脂肪酶基因及其伴侣基因的克隆和同源高效表达

从油污土壤中筛选到一株脂肪酶活性较高的洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia）G63。运用PCR的方法从该菌株中克隆了脂肪酶基因（lip A）及其伴侣基因（lipB）。该脂肪酶基因开放式阅读框（ORF）为1092bp，编码364个氨基酸残基。经KpnI／HindiⅢ酶切，将其克隆到广泛宿主质粒pBBR1Tp载体上，构建成质粒pBBR1-lipAB。通过三亲杂交，在辅助质粒pRK2013的帮助下，转入原宿主菌P．cepaciaG63中，构建成洳A基因同源高效表达的基因工程菌。该菌株在连续转接5次，培养45h后质粒保持率为82．6％，适用于规模化发酵生产。摇床发酵表明，工程菌在60h时酶活达到150．63U／mL，较原始菌株提高3．6倍。

导入脂肪酶基因提高荧光假单胞菌26-2的产酶效率

采用导入脂肪酶基因的方法对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescence)26-2的产酶效率进行实验。实验以质粒ppic9k-lipA为模板,通过PCR的方式在26-2脂肪酶基因的两端引入BamH1和EcoR1的酶切位点,并将该基因与大肠杆菌荧光假单胞菌穿梭质粒pDSK519连接,获得重组质粒pDSK519-lipA,再将重组质粒转入荧光假单胞菌26-2,获得工程菌株P.f luorescence26-2-1。在相同的发酵条件下,工程菌株的发酵液酶活力比原始菌株的发酵液酶活力提高2倍,实现了荧光假单胞菌脂肪酶基因的同源性表达。

表达绿色荧光蛋白重组单核细胞增多性李斯特菌的构建(英文)

将编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因融合到单核细胞增多性李斯特菌actA基因启动子和信号肽下游,应用同源重组技术构建了含gfp的重组李斯特菌突变株.PCR扩增及其产物的酶切鉴定均证实目的基因gfp融合到李斯特菌基因组中.荧光显微镜下可见重组菌体发绿色荧光.SDS-PAGE电泳和免疫印迹结果显示重组李斯特菌表达的GFP分子量约为28 kD,与预计的分子量大小一致.重组菌对鸡胚和小鼠的毒力以及对体外培养细胞的侵袭力均低于野生型李斯特菌.该重组菌可用于研究李斯特菌的致病机理和食品加工过程中微生物污染控制的指示性细菌.

人肝细胞生长因子基因腺病毒重组体的构建及转染血管平滑肌细胞的表达

为探讨构建能表达肝细胞生长因子基因的腺病毒重组体的方法,以及这种腺病毒重组体能否在血管平滑肌细胞表达。将含有肝细胞生长因子基因片段的质粒用限制内切酶酶切,以琼脂糖凝胶电泳回收得到目的基因片段;将它用DNA连接酶插入至腺病毒穿梭质粒中,并用限制内切酶鉴别插入方向,得到插入方向正确的重组腺病毒穿梭质粒。用限制内切酶酶切重组腺病毒穿梭质粒和表达载体,使它们线性化;以电转化方法使它们共转化至BJ5183细胞中进行同源重组,构成肝细胞生长因子基因腺病毒重组体。以脂质体为转染介质,将肝细胞生长因子基因腺病毒重组体转染到人胚肾细胞中进行包装,使病毒复性具有感染能力。用包装后的肝细胞生长因子基因腺病毒重组体感染体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞;经逆转录-聚合酶链反应和蛋白印迹检测发现肝细胞生长因子呈现过表达。此外,酶切及测序发现重组腺病毒穿梭质粒和肝细胞生长因子基因腺病毒重组体是正确的;绿色荧光蛋白标记对重组体在人胚肾细胞中的包装及包装后感染大鼠主动脉平滑肌细胞进行了荧光示踪。结果提示。肝细胞生长因子基因腺病毒重组体构建成功,为血管疾病转基因治疗奠定了基础,具有一定临床价值。

黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在黑曲霉中的同源表达

旨在研究黑曲霉脂肪酶基因在黑曲霉中的同源表达情况。利用黑曲霉基因组作为模板克隆8种脂肪酶基因,与双元表达载体pCAMBIA连接构建8个表达载体。通过原生质体-PEG转化法,实现8个脂肪酶基因在黑曲霉中同源表达,其中转化子MA-H3-PglaA-SglaA脂肪酶活性最高。对该酶进行分离纯化和酶学性质表征,酶最适温度45℃,最适pH 7.5,K^(+)、Mg^(2+)等金属离子对脂肪酶有显著激活作用。酶底物特异性实验发现,该酶对底物pNPA亲和力最高,脂肪酶ANL-H3的K_(m)为1.893 mmol/L,V_(max)为1.610 mmol/(L·min)。该研究为黑曲霉脂肪酶的同源表达提供了有效的策略和数据支持,可为食品级脂肪酶的开发和应用提供理论基础。

Establishment of Chlamydomonas reinhardtii chloroplast expression

An expression vector pACⅢ containing the chimeric gene HAV- VP3P1 and HCV-C gene has been constructed and transferred to C. reinhardtii by the biolistic method. The trans-formants have been identified by PCR, Southern-blotting, Northern-blotting and Western-blotting assays after selecting on resistant medium and incubating in the dark. The results

前列腺癌特异性启动子P(A)PTp的构建及评价

目的构建前列腺癌特异性启动子PSAe(AREc)-PSMAe-TARPp[P(A)PTp],并在腺病毒水平评价其启动目的基因表达的效率和特异性。方法巢式PCR扩增基因组DNA获得PSAe的AREc区基因、PSMAe基因和TARPp基因,并依次连接获得嵌合启动子P(A)PTp。采用Adeasy系统构建并制备P(A)PTp启动增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达的重组腺病毒Ad-pSh-P(A)PTp-EGFP。不同感染复数(multi-plicity of infection,MOI)的Ad-pSh-CMV-EGFP感染各细胞系后48 h,流式细胞术确定最佳MOI;并以最佳MOI的Ad-pSh-P(A)PTp-EGFP感染各细胞系,检测EGFP的表达效率。结果 PCR成功扩增并连接获得嵌合启动子基因P(A)PTp。采用Adeasy系统,构建并制备了重组腺病毒Ad-pSh-P(A)PTp-EGFP。Ad-pSh-CMV-EGFP感染后,流式检测结果显示,前列腺癌细胞PC3和PC3M细胞的最佳MOI为100 MOI;而前列腺癌细胞DU145以及肝癌细胞SMMC-7721和HepG2为250 MOI。最佳MOI的Ad-pSh-P(A)PTp-EGFP感染后,EGFP在各细胞系中的表达效率[P(A)PTvsCMV]为:PC3(25.56%vs77.76%)、DU145(50.50%vs65.26%)、PC3M(30.81%vs89.70%)、HepG2(6.26%vs63.76%)、7721(2.27%vs67.84%)。结论成功构建前列腺癌特异性嵌合启动子P(A)PTp,并证实能在前列腺癌细胞中特异并有效地启动EGFP的表达。