重组绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白的初步复性及细胞生物学活性检测

用逐步稀释透析法将纯化的大肠杆菌表达的重组绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）受体结合区蛋白初步复性，复性后的可溶性蛋白用于竞争抑制ＰＥＡ的细胞毒性实验。将１０μｇ／Ｌ的ＰＥＡ与其敏感细胞Ｌ９２９共孵育，３６ｈ左右可见细胞发生病变死亡，而同时加入复性的重组ＰＥＡ受体结合区蛋白的培养细胞孔与未加ＰＥＡ阴性对照培养细胞一样仍分裂增殖，这种ＰＥＡ细胞毒性抑制作用可持续到所有培养细胞老化死亡。结果表明，重组ＰＥＡ受体结合区蛋白可在体外竞争抑制ＰＥＡ对Ｌ９２９细胞的毒性。

含绿脓杆菌外毒素A受体结合区重组蛋白的纯化

将表达含绿脓杆菌外毒素（ＰＥＡ）受体结合区基因的质粒ｐＥＴ－ＥＡＢ转化到大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，经ＩＰＴＧ诱导表达了含ＰＥＡ受体结合区的重组蛋白（称ＰＥ３４）。ＰＥ３４主要以包涵体形式存在于大肠杆菌中，用溶菌酶－脱氧胆酸钠法结合超声波裂解法破碎细菌，离心制备包涵体。用２ｍｏｌ／Ｌ脲洗涤包涵体后，包涵体纯度可达７５％，在８ｍｏｌ／Ｌ脲存在条件下，ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００凝胶滤过，ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析纯化，获得ＳＤＳ－ＰＡＧＥ１条带的ＰＥ３４，纯度达９５．８％，得率为２４．５％。

绿脓杆菌ATCC27853外毒素PE40基因的扩增与测序

目的扩增绿脓杆菌ATCC27853外毒素基因PE40,并对PCR产物进行测序鉴定,为获得用于构建分子导向药物的毒素弹头基因PE40奠定基础。方法采用PCR技术,以绿脓杆菌ATCC27853基因组DNA为模板,扩增PE40基因并测序。用DNASTAR软件将测得的序列与GenBank中的国际标准产毒株PA103的PE40基因序列进行比较。结果扩增出目的基因片断,长度为1231bp。测序表明,ATCC27853与PA103核苷酸同源性为98%,产生了7个碱基的突变,突变碱基导致第364位的天冬酰胺变成丝氨酸,第506位的丝氨酸变成色氨酸,第515位的丝氨酸变成甘氨酸。但产生变化的3个氨基酸均不是文献报道中的重要活性位点。结论产生变化的3个氨基酸不会对PEA的酶活性及细胞毒性产生很大影响,绿脓杆菌ATCC27853的PE40基因可用作分子导向药物的弹头。

铜绿假单胞菌外毒素A蛋白疫苗的研制现状

铜绿假单胞菌是一种院内感染的常见致病菌,借助疫苗技术对该菌进行免疫防治是目前的研究热点。铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)具有较好的免疫原性,可作为有效的疫苗候选抗原。对PEA蛋白分子、融合蛋白(PEA-Fla、ntPE-M2e、PEIF、PEA-GP5-M、CVN-PE38、PEA-V3MV26、PEA-HphA和IL-18-PE38)、耦合蛋白(PEA-LPS、PEACSP、PEA-Pfs25、CD4-PEA、G17-PE38和PLGA-PEA)以及核酸疫苗等的研制现状进行了综述。

绿脓杆菌抗毒素精制方法与效价测定方法的研究

本文采用胃酶消化──硫酸铵盐析法对绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）免疫马血浆进行了试制提纯，对该法酶处理及热变性中影响精制效果的几个主要因素进行了比较试验，同时对文中采用的４种效价测定方法进行了筛选。结果表明，胃酶消化法可用于ＰＥＡ免疫马血浆的精制；效价测定以生物学方法（细胞毒性中和试验、小鼠致死毒性中和试验）为佳。综合比较试验的结果，本文拟订了ＰＥＡ免疫马血浆精制的“修订法”并与“常规法”进行了精制比较。初步结果表明，修订法的精制效果优于常规法。

绿脓杆菌外毒素A的最新研究进展

在免疫缺失、囊肿性纤维化、烧伤烫伤等患者的临床继发感染中,绿脓杆菌是引起感染的主要病原菌之一,其合成的细胞外毒性物质—绿脓杆菌外毒素A(PEA)被认为是引起感染的最关键内在机制。该文对中外学者们在PEA的结构、功能、提取和纯化方法、重组毒素、基因工程疫苗以及应用等方面的研究进行归纳总结,并对研究和应用中存在的问题加以分析,对预防和治疗绿脓菌感染、抗肿瘤、抗移植排斥和治疗自身免疫性疾病等具有重要而深远的意义。